Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол демонстрирует изоляцию под контролем микроскопии и иммунофлуоресцентное окрашивание легочных вен мышей. Мы подготавливаем образцы тканей, содержащие левое предсердие, легочные вены и соответствующие легкие, и окрашиваем их на сердечные тропонины Т и коннексин 43.

Abstract

Легочные вены (ЛВ) являются основным источником эктопических биений при предсердных аритмиях и играют решающую роль в развитии и прогрессировании фибрилляции предсердий (ФП). ПВ содержат рукава миокарда (МС), состоящие из кардиомиоцитов. Рассеянный склероз участвует в инициации и поддержании мерцательной аритмии, поскольку он сохраняет сходство с работающим миокардом сердца, включая способность генерировать эктопические электрические импульсы. Грызуны широко используются и могут представлять собой отличные животные модели для изучения миокарда легочной вены, поскольку кардиомиоциты широко представлены по всей стенке сосуда. Тем не менее, точное микровскрытие и приготовление мышиных ПВ является сложной задачей из-за небольшого размера органа и сложной анатомии.

Мы демонстрируем протокол микродиссекции под контролем микроскопии для изоляции левого предсердия мыши (ЛП) вместе с ЛВ. Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием сердечных антител к тропонину-Т (цТНТ) и коннексину 43 (Сх43) выполняется для визуализации ЛП и ЛП в полный рост. Визуализация при 10-кратном и 40-кратном увеличении обеспечивает всестороннее представление о структуре ФВ, а также детальное представление об архитектуре миокарда, в частности, подчеркивая присутствие коннексина 43 в МС.

Introduction

Фибрилляция предсердий (ФП) является наиболее распространенной устойчивой аритмией1. Распространенность мерцательной аритмии продолжает расти: ожидается, что в 2060 г. число пациентов в Европе составит ~17,9 млн1. Мерцательная аритмия имеет большое клиническое значение, поскольку является существенным фактором риска развития инфаркта миокарда, сердечной недостаточности или инсульта, что приводит к огромному индивидуальному, социальному и социально-экономическому бремени1. Несмотря на то, что мерцательная аритмия известна уже несколько десятилетий, патофизиология мерцательной аритмии до сих пор до ....

Protocol

Уход за животными и все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу за животными и этике Мюнхенского университета им. Людвига-Максимилиана, а все процедуры с использованием мышей были одобрены Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, РОБ 55.2-2532. Vet_02-1.......

Representative Results

Мы провели микродиссекцию, окрашивание и визуализацию ВП у 10 мышей в возрасте 12-16 недель. Следуя протоколу, мы успешно провели микропрепарирование ФВ вместе с ЛП у всех подопытных мышей и получили срезы с комплексным изображением ФВ у восьми мышей. Обзорные изображения были сделаны при .......

Discussion

С помощью этого протокола мы делимся методом различения и изоляции ВП сердца мыши и проведения на них иммунофлуоресцентного окрашивания. После забора органов сердце и легкие обезвоживали в стерилизованном растворе сахарозы с последующим отделением желудочков от предсердий и долей л?.......

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Немецким центром сердечно-сосудистых исследований (DZHK; 81X3600221to H.V., 81X2600255 to S.C.), Китайским стипендиальным советом (CSC201808130158 R.X.), Немецким научно-исследовательским обществом (DFG; Программа ученого-клинициста в области сосудистой медицины (PRIME), MA 2186/14-1 to P. T.) и Corona Foundation (S199/10079/2019 to S. C.).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesion slidesEpredia10149870
AF568-secondary antibodyInvitrogenA11036Host: Goat, Reactivity: Rabbit
AgaroseBiozym LE840104
Alexa Fluor 488-secondary antibodyCell Signaling Technology4408SHost: Goat, Reactivity: Mouse
Anti-Connexin 43 /GJA1 antibodyAbcamab11370Polyclonal Antibody, Clone: GJA1, Host: Rabbit 
Anti-cTNT antibodyInvitrogenMA5-12960Monoclonal Antibody, Clone: 13-11, Host: Mouse
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
BrushLukas 5486size 6
Cover slipsEpredia24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70Epredia Settings: Specimen temperature: -18 °C, Blade Temperature: -25 °C
DFC365FX cameraLeica 
DM6 B fluorescence microscopeLeica 
Dry ice
Dubecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 1x conc.Gibco14040133500 mL
Dumont #5FS ForcepsF.S.T.91150-202 pieces needed
Fine ScissorsF.S.T.14090-09
Fluorescence mounting mediumDAKOS3023
Graefe ForcepsF.S.T.11052-10
Hoechst 33342InvitrogenH3570Cell nuclei counterstaining
ImageJFIJIanalysis and processing software
LAS XLeica Imaging software for Leica DM6 B
Microtome blades S35Feather207500000
Microwave
Normal goat serumSigma-AldrichS26-M
O.C.T. compoundTissue-Tek4583
Paraformaldehyde 16%Pierce28908methanol-free
Pasteur pipettesVWR612-1681
Petri dishTPP93100100 mm diameter
Rocker 3D digitalIKA Schüttler00040010000
Slide staining jarsEasyDipM900-12
Specimen MoldsTissue-Tek Cryomold455725 mm x 20 mm x 5 mm
StainTray M920 staining systemStainTray631-1923Staining system for 20 slides
Sterican NeedleBraun4657705G 27 - used for injection (step 2) and pinning (step 3 and 4) in the protocol
Student Vannas Spring ScissorsF.S.T.91500-09
Super PAP Pen Liquid BlockerSuper PAP PenN71310-N
SyringesBraun4606108V10 mL
Tris baseRocheTRIS-ROcomponent for 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP2287

References

  1. Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
  2. Wijesurendra, R. S., Casadei, B.

Explore More Articles

201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved