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Descrevemos aqui um ensaio in house de atividade do fator tecidual da vesícula extracelular. Ensaios baseados em atividade e ensaios baseados em antígenos têm sido usados para medir o fator tecidual em vesículas extracelulares de amostras de plasma humano. Os ensaios baseados em atividade têm maior sensibilidade e especificidade do que os ensaios baseados em antígenos.
O fator tecidual (FT) é um receptor transmembrana para o fator (F) VII e FVIIa. O complexo TF/FVIIa inicia a cascata de coagulação ativando tanto o FIX quanto o FX. O FT é liberado das células para a circulação na forma de vesículas extracelulares (EVs). O nível de EVs TF-positivos (+) está aumentado em várias doenças, incluindo câncer, infecções bacterianas e virais e cirrose, e está associado a trombose, coagulação intravascular disseminada, gravidade da doença e mortalidade. Existem duas maneiras de medir os EVs TF+ no plasma: ensaios baseados em antígeno e atividade. Os dados indicam que os ensaios baseados em atividade têm maior sensibilidade e especificidade do que os ensaios baseados em antígenos. Este artigo descreve nosso ensaio interno de atividade de EVTF baseado em um ensaio de geração FXa de dois estágios. FVIIa, FX e cálcio são adicionados às amostras contendo TF+ EV para gerar FXa na presença e ausência de anticorpo anti-TF para distinguir a geração FXa TF-dependente da geração FXa TF-independente. Um substrato cromogênico clivado por FXa é usado para determinar o nível de FXa, enquanto uma curva padrão gerada com um TF recombinante relipidado é usada para a determinação da concentração de FT. Este ensaio interno de atividade de EVTF tem maior sensibilidade e especificidade do que um ensaio comercial de atividade de FT.
A coagulação sanguínea é iniciada com a ligação do fator (F) VII/VIIa ao fator tecidual (FT)1. O complexo TF/FVIIa ativa tanto o FIX quanto o FX para ativar a coagulação sanguínea1. Existem duas formas de TF completo, ligado à membrana: criptografado e ativo. Além disso, há uma forma alternativamente emendada de FT (asTF). A esfingomielina e a fosfatidilcolina no folheto externo da membrana celular mantêm os FT criptografados 2,3,4. Quando as células são ativadas ou danificadas, a scramblase fosfolipídica transfere fosfatidilser....
A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa da University of North Carolina at Chapel Hill (número do protocolo: 14-2108).
1. Coleta de sangue de doadores
Um resultado bem-sucedido fornece um valor de controle positivo de ≥0,5 pg/mL e um valor de controle negativo de <0,5 pg/mL. É melhor encontrar um respondedor de LPS alto com atividade de >1,0 pg/mL EVTF para um controle positivo. O resultado representativo mostra a atividade EVTF de EVs isolados do plasma do sangue total de 11 doadores saudáveis, com e sem ativação do LPS (Figura 4). Seis dos onze doadores (Doadores 2, 4, 5, 8, 10, 11) responderam de médio a alto LPS, enquanto cinco .......
Aqui, o protocolo do nosso ensaio interno de atividade EVTF é apresentado. Há três etapas críticas no protocolo. Ao reconstituir a pelota de EV, é importante pipetar para cima e para baixo no local da pelota de EV, mesmo que ela não seja visível. A reconstituição incompleta da pastilha de EV resultará em um falso negativo ou subestimação dos valores de atividade de EVTF das amostras. Em segundo lugar, o uso de HBSA-Ca(+) é crítico na etapa 6.5 do protocolo porque a geração FXa não pode ser gerada sem cá.......
Este trabalho foi apoiado pelo NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) e pela cátedra John C. Parker (N.M.). Gostaríamos de agradecer à Sra. Sierra J. Archibald por seus comentários úteis
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |
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