Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы опишем собственный анализ активности фактора внеклеточной везикулярной ткани. Анализы, основанные на активности, и анализы на основе антигенов были использованы для измерения тканевого фактора во внеклеточных везикулах из образцов плазмы крови человека. Анализы, основанные на активности, имеют более высокую чувствительность и специфичность, чем анализы на основе антигенов.

Abstract

Тканевый фактор (ТФ) является трансмембранным рецептором для факторов (F) VII и FVIIa. Комплекс TF/FVIIa инициирует коагуляционный каскад, активируя как FIX, так и FX. ТФ высвобождается из клеток в кровоток в виде внеклеточных везикул (ВВ). Уровень ТФ-положительных (+) ВВ повышен при различных заболеваниях, включая онкологические, бактериальные и вирусные инфекции, цирроз печени, и связан с тромбозом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, тяжестью заболевания и летальностью. Существует два способа измерения ТФ+ ВВ в плазме: анализ на основе антигена и анализ на основе активности. Данные свидетельствуют о том, что анализы, основанные на активности, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, чем анализы на основе антигенов. В этом документе описывается наш собственный анализ активности EVTF, основанный на двухступенчатом анализе генерации FXa. FVIIa, FX и кальций добавляют к образцам, содержащим ТФ+ EV, для генерации FXa в присутствии и отсутствии антител к ТФ, чтобы отличить ТФ-зависимую генерацию FXa от TF-независимой генерации FXa. Для определения уровня FXa используется хромогенный субстрат, расщепленный FXa, в то время как стандартная кривая, сгенерированная с помощью релипированного рекомбинантного TF, используется для определения концентрации TF. Этот собственный анализ активности ЭВТФ обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем коммерческий анализ активности ТФ.

Introduction

Свертывание крови начинается со связывания фактора (F) VII/VIIa с тканевым фактором (TF)1. Комплекс TF/FVIIa активирует как FIX, так и FX для активации свертывания крови1. Существует две формы полноразмерного мембранного ТФ: зашифрованный и активный. Кроме того, существует альтернативно сплайсированная форма ТФ (asTF). Сфингомиелин и фосфатидилхолин в наружной створке клеточной мембраны поддерживают ТФ в зашифрованном состоянии 2,3,4. Когда клетки активируются или повреждаются, фосфолипидная скрамблаза переносит фосфатидилсерин ....

Protocol

Исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Университета Северной Каролины в Чапел-Хилл (номер протокола: 14-2108).

1. Забор крови у доноров

  1. Соберите цельную кровь с помощью чистой венепункции в локтевую вену иглой 21 G. Первые 3 мл крови .......

Representative Results

При успешном получении положительного контрольного значения ≥0,5 пг/мл и отрицательного контрольного значения <0,5 пг/мл. Для положительного контроля лучше всего найти ответчик с высоким ЛПС с активностью EVTF >1,0 пг/мл. Репрезентативный результат показывает активность ЭВТФ ВВ, выделенных .......

Discussion

Здесь представлен протокол нашего собственного анализа активности ЭВТФ. Протокол состоит из трех важнейших этапов. При восстановлении гранулы EV важно проводить пипеткой вверх и вниз в том месте, где находится гранула EV, даже если она не видна. Неполное восстановление гранулы EV приведе?.......

Acknowledgements

Эта работа была поддержана R35HL155657 NIH NHLBI (Нью-Мексико) и профессором Джона С. Паркера (Нью-Мексико). Мы хотели бы поблагодарить г-жу Сьерру Арчибальд за ее полезные комментарии

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifugeany companyN/AWe use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129).
1.5 mL tube for ultracentrifugeany companyN/AWe use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448)
15 mL tubeany companyN/AWe use the one from VWR (Catalog number: 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapterBD367281
96-well plateany companyN/AWe use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338).
BD Vacutainer Citrate TubesBD363083
Bovine serum albuminSigma AldrichA9418
Calcium chlorideFisher ScientificC69-500
Centrifuge for 1.5 mL tubeany companyN/AWe use the Centrifuge 5417R (Eppendorf).
Centrifuge for 15 mL tubeany companyN/AWe use the Centrifuge 5810R (Eppendorf).
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrateSigma AldrichE6511
HepesSigma AldrichH4034
Human FVIIaEnzyme Research LaboratoryHFVIIaThe solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Human FXEnzyme Research LaboratoryHFX1010The solution should be diluted with HBSA-Ca(+).
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1Fisher Scientific550252
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4Sigma AldrichL2630There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes.
Mouse IgGSigma AldrichI5381
Pefachrome FXa 8595Enzyme Research Laboratory085-27
Plate readerany companyN/AWe use the SpectraMax i3x from Molecular Devices
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade InnovinSiemens10873566
Sodium chloride Fisher ScientificS271-500
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima TLX
Ultracentrifuge rotorBeckman CoulterTLA-55

References

  1. Grover, S. P., Mackman, N. Tissue factor: an essential mediator of hemostasis and trigger of thrombosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 709-725 (2018).
  2. Shaw, A. W., Pureza, V. S., Sligar, S. G., Morrissey, J. H.

Explore More Articles

202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved