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O presente protocolo fornece descrições detalhadas para o isolamento eficiente de vesículas extracelulares urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Além disso, engloba análises subsequentes, incluindo western blotting, proteômica e fosfoproteômica.
Vesículas extracelulares (EVs) de biofluidos têm recentemente ganhado atenção significativa no campo da biópsia líquida. Liberados por quase todos os tipos de células, eles fornecem um instantâneo em tempo real das células hospedeiras e contêm uma riqueza de informações moleculares, incluindo proteínas, em particular aquelas com modificações pós-traducionais (PTMs), como a fosforilação, como o principal ator das funções celulares e do início e progressão da doença. No entanto, o isolamento de EVs de biofluidos permanece desafiador devido aos baixos rendimentos e impurezas dos métodos atuais de isolamento de EV, dificultando a análise a jusante de cargas de EV, como fosfoproteínas de EV. Aqui, descrevemos um método rápido e eficaz de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas funcionalizadas para isolamento de EV de biofluidos como urina humana e análise proteômica a jusante e fosfoproteômica após isolamento de EV. O protocolo possibilitou um alto rendimento de recuperação de EVs urinários e perfis sensíveis de proteoma EV e fosfoproteoma. Além disso, a versatilidade deste protocolo e considerações técnicas relevantes também são abordadas aqui.
As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas encapsuladas em membrana secretadas por todos os tipos de células e estão presentes em biofluidos como sangue, urina, saliva, etc.1,2,3,4. Os EVs carregam uma carga de diversas moléculas bioativas que refletem o estado fisiológico e patológico de suas células hospedeiras e, portanto, funcionam como fatores cruciais na progressão da doença 4,5,6. Além disso, extensos estudos estabeleceram que marca....
Todas as amostras de urina foram coletadas de indivíduos saudáveis após consentimento informado. Os experimentos estavam em conformidade com todos os padrões éticos envolvendo amostras humanas e em conformidade com as diretrizes do Programa de Proteção à Pesquisa em Seres Humanos da Universidade de Purdue.
1. Coleta de amostras
Este protocolo demonstra um fluxo de trabalho abrangente desde o isolamento de EVs até análises proteômicas e fosfoproteômicas a jusante (Figura 1). As amostras de urina em triplicata foram submetidas ao isolamento EV. Os EVs isolados foram caracterizados por western blotting e subsequentemente processados para preparação de amostras proteômicas baseadas em espectrometria de massa, incluindo extração de proteínas, digestão enzimática e limpeza de peptídeos. Para a análise fosfo.......
O isolamento eficaz de EV é um pré-requisito essencial para detectar proteínas e fosfoproteínas pouco abundantes em EVs. Apesar do desenvolvimento de inúmeros métodos para suprir essa necessidade, a maioria ainda sofre de limitações como má recuperação ou baixa reprodutibilidade, que impedem sua utilização em estudos em larga escala e cenários clínicos de rotina. O DUC é geralmente considerado o método mais comum para o isolamento de EV, e as etapas adicionais de lavagem são normalmente aplicadas para a.......
Os autores declaram um interesse financeiro concorrente. Anton Iliuk e W. Andy Tao são co-fundadores da Tymora Analytical Operations, que desenvolveu contas EVtrap e comercializou o kit de enriquecimento de fosfopeptídeos PolyMAC.
Este trabalho foi financiado em parte pelos subsídios do NIH 3RF1AG064250 e R44CA239845.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL microcentrifuge tube | Life Science Products | M-1700C-LB | |
1.5 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
15 mL conical centrifuge tube | Corning | 352097 | |
15 mL tube magnetic separator rack | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074P2 | |
Benchtop incubated shaker | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Thermocell Mixing Block MB-101 |
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 13403S | |
Chloroacetamide | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution. |
Ethyl acetate | Fisher Scientific | E145-4 | Precipitates detergents |
Evosep One | Evosep | Liquid chromatography system | |
Evotips | Evosep | EV2013 | Sample loading for Evosep One system |
EVtrap | Tymora Analytical | Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer | |
Immobilon-FL PVDF Membrane | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrane |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9 | Bruker | 1893473 | Separation column |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Phosphotase inhibitor. |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher | 23225 | |
Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP substrate |
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit | Tymora Analytical | Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment | |
Sodium deoxycholate | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
Sodium lauroyl sarcosinate | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution. |
timsTOF HT | Bruker | Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry | |
TopTip C-18 (10-200 μL) tips | Glygen | TT2C18.96 | Desalting method |
Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | For EV elution. |
Triethylammonium bicabonate buffer | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
Trifluoroacetic acid | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma -Aldrich | C4706 | Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles). |
Trypsin/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
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