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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para o isolamento eficiente de vesículas extracelulares urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Além disso, engloba análises subsequentes, incluindo western blotting, proteômica e fosfoproteômica.

Abstract

Vesículas extracelulares (EVs) de biofluidos têm recentemente ganhado atenção significativa no campo da biópsia líquida. Liberados por quase todos os tipos de células, eles fornecem um instantâneo em tempo real das células hospedeiras e contêm uma riqueza de informações moleculares, incluindo proteínas, em particular aquelas com modificações pós-traducionais (PTMs), como a fosforilação, como o principal ator das funções celulares e do início e progressão da doença. No entanto, o isolamento de EVs de biofluidos permanece desafiador devido aos baixos rendimentos e impurezas dos métodos atuais de isolamento de EV, dificultando a análise a jusante de cargas de EV, como fosfoproteínas de EV. Aqui, descrevemos um método rápido e eficaz de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas funcionalizadas para isolamento de EV de biofluidos como urina humana e análise proteômica a jusante e fosfoproteômica após isolamento de EV. O protocolo possibilitou um alto rendimento de recuperação de EVs urinários e perfis sensíveis de proteoma EV e fosfoproteoma. Além disso, a versatilidade deste protocolo e considerações técnicas relevantes também são abordadas aqui.

Introduction

As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas encapsuladas em membrana secretadas por todos os tipos de células e estão presentes em biofluidos como sangue, urina, saliva, etc.1,2,3,4. Os EVs carregam uma carga de diversas moléculas bioativas que refletem o estado fisiológico e patológico de suas células hospedeiras e, portanto, funcionam como fatores cruciais na progressão da doença 4,5,6. Além disso, extensos estudos estabeleceram que marca....

Protocol

Todas as amostras de urina foram coletadas de indivíduos saudáveis após consentimento informado. Os experimentos estavam em conformidade com todos os padrões éticos envolvendo amostras humanas e em conformidade com as diretrizes do Programa de Proteção à Pesquisa em Seres Humanos da Universidade de Purdue.

1. Coleta de amostras

  1. Centrifugar 12 mL de amostra de urina em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL por 10 min a 2.500 x g, 4 °C para remover .......

Representative Results

Este protocolo demonstra um fluxo de trabalho abrangente desde o isolamento de EVs até análises proteômicas e fosfoproteômicas a jusante (Figura 1). As amostras de urina em triplicata foram submetidas ao isolamento EV. Os EVs isolados foram caracterizados por western blotting e subsequentemente processados para preparação de amostras proteômicas baseadas em espectrometria de massa, incluindo extração de proteínas, digestão enzimática e limpeza de peptídeos. Para a análise fosfo.......

Discussion

O isolamento eficaz de EV é um pré-requisito essencial para detectar proteínas e fosfoproteínas pouco abundantes em EVs. Apesar do desenvolvimento de inúmeros métodos para suprir essa necessidade, a maioria ainda sofre de limitações como má recuperação ou baixa reprodutibilidade, que impedem sua utilização em estudos em larga escala e cenários clínicos de rotina. O DUC é geralmente considerado o método mais comum para o isolamento de EV, e as etapas adicionais de lavagem são normalmente aplicadas para a.......

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado em parte pelos subsídios do NIH 3RF1AG064250 e R44CA239845.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeLife Science ProductsM-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rackSergi Lab Supplies1005
15 mL conical centrifuge tubeCorning 352097
15 mL tube magnetic separator rackSergi Lab Supplies1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074P2
Benchtop incubated shakerBioerDIS-87999-3367802Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAbCell Signaling Technology13403S
ChloroacetamideSigma -AldrichC0267-100GUsed for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate Fisher Scientific E145-4Precipitates detergents
Evosep One EvosepLiquid chromatography system
EvotipsEvosepEV2013Sample loading for Evosep One system 
EVtrapTymora AnalyticalFunctionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer 
Immobilon-FL PVDF MembraneSigma -AldrichIPFL00010Blotting membrane 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9Bruker 1893473Separation column 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2Sigma -AldrichP5726-5ML100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3Sigma -AldrichP0044-1ML100X,  Phosphotase inhibitor. 
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher23225
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106HRP substrate 
PolyMAC phosphopeptide enrichment kitTymora AnalyticalPolymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate Sigma -AldrichD6750-10GDetergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate Sigma -AldrichL9150-50GDetergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HTBrukerTrapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips GlygenTT2C18.96Desalting method
TriethylamineSigma -Aldrich471283-100MLFor EV elution. 
Triethylammonium bicabonate bufferSigma -AldrichT7408-100ML1 M
Trifluoroacetic acidSigma -Aldrich302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma -AldrichC4706Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIXThermoFisherPIA41007

References

  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Maacha, S., et al.

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