Isolamento Químico por Afinidade de Vesículas Extracelulares de Biofluidos para Análise Proteômica e Fosfoproteômica

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para o isolamento eficiente de vesículas extracelulares urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Além disso, engloba análises subsequentes, incluindo western blotting, proteômica e fosfoproteômica.

Vesículas extracelulares (EVs) de biofluidos têm recentemente ganhado atenção significativa no campo da biópsia líquida. Liberados por quase todos os tipos de células, eles fornecem um instantâneo em tempo real das células hospedeiras e contêm uma riqueza de informações moleculares, incluindo proteínas, em particular aquelas com modificações pós-traducionais (PTMs), como a fosforilação, como o principal ator das funções celulares e do início e progressão da doença. No entanto, o isolamento de EVs de biofluidos permanece desafiador devido aos baixos rendimentos e impurezas dos métodos atuais de isolamento de EV, dificultando a análise a jusante de cargas de EV, como fosfoproteínas de EV. Aqui, descrevemos um método rápido e eficaz de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas funcionalizadas para isolamento de EV de biofluidos como urina humana e análise proteômica a jusante e fosfoproteômica após isolamento de EV. O protocolo possibilitou um alto rendimento de recuperação de EVs urinários e perfis sensíveis de proteoma EV e fosfoproteoma. Além disso, a versatilidade deste protocolo e considerações técnicas relevantes também são abordadas aqui.

As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas encapsuladas em membrana secretadas por todos os tipos de células e estão presentes em biofluidos como sangue, urina, saliva, etc.1,2,3,4. Os EVs carregam uma carga de diversas moléculas bioativas que refletem o estado fisiológico e patológico de suas células hospedeiras e, portanto, funcionam como fatores cruciais na progressão da doença ^4,5,6. Além disso, extensos estudos estabeleceram que marca....

Todas as amostras de urina foram coletadas de indivíduos saudáveis após consentimento informado. Os experimentos estavam em conformidade com todos os padrões éticos envolvendo amostras humanas e em conformidade com as diretrizes do Programa de Proteção à Pesquisa em Seres Humanos da Universidade de Purdue.

1. Coleta de amostras

1. Centrifugar 12 mL de amostra de urina em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL por 10 min a 2.500 x g, 4 °C para remover .......

Este protocolo demonstra um fluxo de trabalho abrangente desde o isolamento de EVs até análises proteômicas e fosfoproteômicas a jusante (Figura 1). As amostras de urina em triplicata foram submetidas ao isolamento EV. Os EVs isolados foram caracterizados por western blotting e subsequentemente processados para preparação de amostras proteômicas baseadas em espectrometria de massa, incluindo extração de proteínas, digestão enzimática e limpeza de peptídeos. Para a análise fosfo.......

O isolamento eficaz de EV é um pré-requisito essencial para detectar proteínas e fosfoproteínas pouco abundantes em EVs. Apesar do desenvolvimento de inúmeros métodos para suprir essa necessidade, a maioria ainda sofre de limitações como má recuperação ou baixa reprodutibilidade, que impedem sua utilização em estudos em larga escala e cenários clínicos de rotina. O DUC é geralmente considerado o método mais comum para o isolamento de EV, e as etapas adicionais de lavagem são normalmente aplicadas para a.......

Este trabalho foi financiado em parte pelos subsídios do NIH 3RF1AG064250 e R44CA239845.