הדמיה של מונוקרבוקסילטים ומטבוליטים רלוונטיים אחרים במוח הזחל לשעבר Vivo Drosophila באמצעות חיישנים מקודדים גנטית

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לדמיין את ההובלה של מונוקרבוקסילטים, גלוקוז ו- ATP בתאי גלייה ונוירונים באמצעות חיישנים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה Förster המקודדים גנטית בהכנת מוח זחל דרוזופילה ex-vivo .

Abstract

דרישות האנרגיה הגבוהות של המוח עקב פעילות חשמלית הן אחת התכונות הבולטות ביותר שלהם. דרישות אלה נפגשות על ידי ייצור ATP מגלוקוז ומטבוליטים שלו, כגון monocarboxylates לקטט ו pyruvate. עדיין לא ברור כיצד תהליך זה מוסדר או מי הם שחקני המפתח, במיוחד בדרוזופילה.

באמצעות חיישנים מבוססי העברת אנרגיה בתהודה Förster המקודדים גנטית, אנו מציגים שיטה פשוטה למדידת ההובלה של מונוקרבוקסילטים וגלוקוז בתאי גלייה ובתאי עצב בהכנת מוח זחל דרוזופילה ex-vivo . הפרוטוקול מתאר כיצד לנתח ולהצמיד מוח זחל המבטא את אחד החיישנים לכיסוי זכוכית.

אנו מציגים תוצאות של ניסוי שלם שבו העברת לקטט נמדדה במוחות של זחלים על ידי הפלת טרנספורטרים מונוקרבוקסילטים שזוהו בעבר בתאי גלייה. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד להגביר במהירות את הפעילות העצבית ולעקוב אחר שינויים מטבוליטים במוח הפעיל. השיטה המתוארת, המספקת את כל המידע הדרוש, יכולה לשמש לניתוח רקמות חיות אחרות של דרוזופילה .

Introduction

למוח יש דרישות אנרגיה גבוהות בשל העלות הגבוהה של שחזור שיפועי יונים בנוירונים הנגרמים על ידי ייצור ושידור אותות חשמליים עצביים, כמו גם שידור סינפטי ^1,2. דרישה גבוהה זו לאנרגיה נחשבת מזה זמן רב כמסופקת על ידי חמצון מתמשך של גלוקוז לייצור ATP³. טרנספורטרים ספציפיים במחסום הדם-מוח מעבירים את הגלוקוז בדם למוח. רמות גליקמיות קבועות מבטיחות שהמוח יקבל אספקה קבועה של גלוקוז⁴. באופן מעניין, עדויות ניסיוניות הולכות וגדלות מצביעות על כך שמולקולות שמקורן במטבוליזם של גלוקוז, כגון לקטט ופירובט, ממלאות תפקיד חשוב בייצור האנרגיה של תאי המוח ^5,6

Protocol

1. תחזוקת זבובים וסנכרון זחלים

1. כדי לבצע ניסויים אלה, השתמשו בתרביות זבובים שגודלו בטמפרטורה של 25°C על מזון דרוזופילה סטנדרטי המורכב מ-10% שמרים, 8% גלוקוז, 5% קמח חיטה, 1.1% אגר, 0.6% חומצה פרופיונית ו-1.5% מתילפרבן.
2. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בשורות הבאות: w¹¹¹⁸ (.......

Discussion

השימוש במודל דרוזופילה לחקר חילוף החומרים במוח הוא חדש יחסית²⁶, והוכח כי הוא חולק מאפיינים רבים יותר עם מטבוליזם של יונקים מהצפוי, אשר נחקר בעיקר במבחנה בתרביות נוירונים ראשוניות או בפרוסות מוח. דרוזופילה מצטיינת בניסויי in vivo הודות לסוללת הכלים הגנטיים והח.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-