Visualizzazione dei monocarbossilati e di altri metaboliti rilevanti nel cervello larvale ex vivo di Drosophila utilizzando sensori geneticamente codificati

Summary

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare il trasporto di monocarbossilati, glucosio e ATP nelle cellule gliali e nei neuroni utilizzando sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Förster geneticamente codificati in una preparazione cerebrale larvale di Drosophila ex-vivo .

Abstract

L'elevato fabbisogno energetico del cervello dovuto all'attività elettrica è una delle loro caratteristiche più distintive. Questi requisiti sono soddisfatti dalla produzione di ATP dal glucosio e dai suoi metaboliti, come i monocarbossilati lattato e piruvato. Non è ancora chiaro come questo processo sia regolato o chi siano gli attori chiave, in particolare in Drosophila.

Utilizzando sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Förster codificati geneticamente, presentiamo un metodo semplice per misurare il trasporto di monocarbossilati e glucosio nelle cellule gliali e nei neuroni in una preparazione cerebrale larvale di Drosophila ex-vivo . Il protocollo descrive come sezionare e far aderire un cervello larvale che esprime uno dei sensori su un vetrino coprioggetto.

Presentiamo i risultati di un intero esperimento in cui il trasporto del lattato è stato misurato nel cervello larvale abbattendo i trasportatori di monocarbossilati precedentemente identificati nelle cellule gliali. Inoltre, dimostriamo come aumentare rapidamente l'attività neuronale e monitorare i cambiamenti dei metaboliti nel cervello attivo. Il metodo descritto, che fornisce tutte le informazioni necessarie, può essere utilizzato per analizzare altri tessuti viventi di Drosophila .

Introduction

Il cervello ha un elevato fabbisogno energetico a causa dell'elevato costo del ripristino dei gradienti ionici nei neuroni causati dalla generazione e dalla trasmissione del segnale elettrico neuronale, nonché dalla trasmissione sinaptica ^1,2. A lungo si è pensato che questa elevata richiesta di energia fosse soddisfatta dalla continua ossidazione del glucosio per produrre ATP³. Trasportatori specifici alla barriera emato-encefalica trasferiscono il glucosio nel sangue al cervello. Livelli glicemici costanti assicurano che il cervello riceva un apporto costante di glucosio

Protocol

1. Mantenimento del ceppo di mosca e sincronizzazione larvale

1. Per eseguire questi esperimenti, utilizzare colture di moscerini allevate a 25 °C su un alimento standard a base di Drosophila composto dal 10% di lievito, dall'8% di glucosio, dal 5% di farina di frumento, dall'1,1% di agar, dallo 0,6% di acido propionico e dall'1,5% di metilparabene.
2. Per seguire questo protocollo, utilizzare le seguenti linee: w¹¹¹⁸ (background di controllo sperimentale), OK6.......

Discussion

L'uso del modello Drosophila per lo studio del metabolismo cerebrale è relativamente nuovo²⁶ ed è stato dimostrato che condivide più caratteristiche con il metabolismo dei mammiferi di quanto ci si aspettasse, che è stato studiato principalmente in vitro in colture di neuroni primari o fette di cervello. La Drosophila eccelle negli esperimenti in vivo grazie alla batteria di strumenti genetici e sensori geneticamente codificati disponibili che consentono ai .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu	-
Cell-R Software	Olympus	-
CG-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30
DV2-emission splitting system	Photometrics	-
Glass coverslips (25 mm diameter)	Marienfeld	111650	Germany
Glucose	Sigma	G8270
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ software	National Institues of Health	Version 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective	Olympus	-
Methylparaben	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Motor neuron driver
Picrotoxin	Sigma	P1675S	CAUTION-Fatal if swallowed
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Propionic Acid	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Glial cell driver (all)
Sodium Lactate	Sigma	71718
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI	Olympus	-
Sucrose	Sigma	S0389
Trehalose	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	ATP sensor
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi line
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Glucose sensor
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Calcium sensor
UAS-Laconic	Sierralta Lab	-	Lactate sensor
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat	-	CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective	Olympus	-