A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Здесь мы представляем протокол визуализации транспорта монокарбоксилатов, глюкозы и АТФ в глиальных клетках и нейронах с использованием генетически закодированных датчиков резонансной передачи энергии Фёрстера в препарате головного мозга личинки дрозофилы ex-vivo .
Высокая потребность мозга в энергии из-за электрической активности является одной из его наиболее отличительных особенностей. Этим требованиям удовлетворяет производство АТФ из глюкозы и ее метаболитов, таких как монокарбоксилаты лактат и пируват. До сих пор неясно, как регулируется этот процесс и кто является ключевыми игроками, особенно в случае с дрозофилами.
Используя генетически закодированные датчики переноса энергии резонанса Фёрстера, мы представляем простой метод измерения транспорта монокарбоксилатов и глюкозы в глиальных клетках и нейронах в препарате головного мозга личинки дрозофилы ex-vivo . Протокол описывает, как препарировать и прикрепить мозг личинки, экспрессирующий один из датчиков, к стеклянному покровному стеклу.
Мы представляем результаты целого эксперимента, в котором транспорт лактата измерялся в мозге личинок путем сбивания ранее идентифицированных монокарбоксилатных транспортеров в глиальных клетках. Кроме того, мы демонстрируем, как быстро повысить нейронную активность и отслеживать метаболитные изменения в активном мозге. Описанный метод, дающий всю необходимую информацию, может быть использован для анализа других живых тканей дрозофилы .
Мозг предъявляет высокие потребности в энергии из-за высоких затрат на восстановление ионных градиентов в нейронах, вызванных генерацией и передачей нейрональных электрических сигналов, а также синаптической передачей 1,2. Долгое время считалось, что эта высокая потребность в энергии удовлетворяется за счет непрерывного окисления глюкозы с образованиемАТФ3. Специфические транспортеры на гематоэнцефалическом барьере переносят глюкозу из крови в мозг. Постоянный уровень гликемии гарантирует, что мозг получает стабильное поступление глюкозы4. Интересно, что растущее....
1. Поддержание штамма мух и синхронизация личинок
В течение 1 ч эта процедура позволяет легко измерять внутриклеточные изменения флуоресценции монокарбоксилатных и глюкозных сенсоров. Как показано на рисунке 4, лаконичные сенсоры как в глиальных клетках, так и в двигательных нейронах реагируют на лактат 1 мМ с одинаков.......
Использование модели дрозофилы для изучения метаболизма мозга являетсяотносительно новым, и было показано, что она имеет больше общих характеристик с метаболизмом млекопитающих, чем ожидалось, который в основном изучался in vitro в культурах первичных нейронов или.......
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих или финансовых интересов.
Мы благодарим всех сотрудников Sierralta Lab. Эта работа была поддержана FONDECYT-Iniciación 11200477 (AGG) и FONDECYT Regular 1210586 (JS). UAS-FLII12Pglu700μδ6 (датчик глюкозы) был любезно предоставлен Пьером-Ивом Пласе (Pierre-Yves Plaçais) и Томасом Преатом (Thomas Preat), CNRS-Paris.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose | Sigma | A9539 | |
CaCl2 | Sigma | C3881 | |
CCD Camera ORCA-R2 | Hamamatsu | - | |
Cell-R Software | Olympus | - | |
CG-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7011 | Fat body driver |
Dumont # 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
DV2-emission splitting system | Photometrics | - | |
Glass coverslips (25 mm diameter) | Marienfeld | 111650 | Germany |
Glucose | Sigma | G8270 | |
GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 8,0,2 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
ImageJ software | National Institues of Health | Version 1,53t | |
KCl | Sigma | P9541 | |
LUMPlanFl 40x/0.8 water immersion objective | Olympus | - | |
Methylparaben | Sigma | H5501 | |
MgCl2 | Sigma | M1028 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
OK6-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | Motor neuron driver | |
Picrotoxin | Sigma | P1675S | CAUTION-Fatal if swallowed |
Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
Propionic Acid | Sigma | P1386 | |
Repo-GAL4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 7415 | Glial cell driver (all) |
Sodium Lactate | Sigma | 71718 | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
Spinning Disk fluorescence Microscope BX61WI | Olympus | - | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Trehalose | US Biological | T8270 | |
UAS-AT1.03NL | Kyoto Drosophila Stock Center | 117012 | ATP sensor |
UAS-Chk RNAi GD1829 | Vienna Drosophila Resource Center | v37139 | Chk RNAi line |
UAS-FLII12Pglu700md6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 93452 | Glucose sensor |
UAS-GCaMP6f | Bloomington Drosophila Stock Center | 42747 | Calcium sensor |
UAS-Laconic | Sierralta Lab | - | Lactate sensor |
UAS-Pyronic | Pierre Yves Placais/Thomas Preat | - | CNRS-Paris |
UMPlanFl 20x/0.5 water immersion objective | Olympus | - |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved