העברה תת-רשתית של אבות פוטורצפטור שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים בעכברי RD10

Summary

אנו מתארים פרוטוקול מפורט להכנת תאי אב קולטי אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (photoreceptor) שמקורם בהקפאה, ואת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי RD10 .

Abstract

רגנרציה של תאים קולטי אור באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים היא טיפול מבטיח לטיפול במחלות רשתית תורשתיות והזדקנות בשלבים מתקדמים. הראינו שמטריצת איזופורם למינין ספציפית לרשתית רקומביננטית אנושית מסוגלת לתמוך בהתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לאבות קולטי אור. בנוסף, הזרקה תת-רשתית של תאים אלה הראתה גם שיקום חלקי במודלים של מכרסמים וארנבים rd10 . הזרקה תת-רשתית ידועה כשיטה מבוססת המשמשת להעברת תרכובות פרמצבטיות לתאי קולטני האור ולשכבת אפיתל פיגמנט ברשתית (RPE) של העין בשל קרבתה לחלל המטרה. הוא שימש גם להעברת וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו לחלל התת-רשתית לטיפול במחלות רשתית. ההעברה התת-רשתית של תרכובות ותאים פרמצבטיים במודל מורין מאתגרת בשל האילוץ בגודל גלגל העין של מורין. פרוטוקול זה מתאר את ההליך המפורט להכנת תאי אב קולטני אור שמקורם בתאי גזע עובריים עובריים (hESC) להזרקה ואת טכניקת ההעברה התת-רשתית של תאים אלה בעכברי רטיניטיס פיגמנטוזה גנטיים, עכברי RD10 . גישה זו מאפשרת טיפול תאי לאזור הממוקד, במיוחד לשכבה הגרעינית החיצונית של הרשתית, שם מתרחשות מחלות המובילות לניוון קולטני אור.

Introduction

מחלות רשתית תורשתיות וניוון מקולרי הקשור לגיל מובילות לאובדן תאים קולטי אור ובסופו של דבר לעיוורון. הפוטורצפטור ברשתית הוא שכבת המקטע החיצוני של הרשתית המורכבת מתאים מיוחדים האחראים על פוטוטרנסדוקציה (כלומר, המרת אור לאותות עצביים). תאי הפוטורצפטור של המוט והחרוט סמוכים לשכבת הפיגמנטציה ברשתית (RPE)¹. טיפול בתחליפי תאים קולטי אור כדי לפצות על אובדן התא היה גישה טיפולית מתפתחת ומתפתחת. תאי גזע עובריים (ESCs)^2,3,4, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) שמקורם בתאי RPE, ותאי אב ברשתית (RPCs)^4,5,6,7,8

Protocol

הניסויים in vivo נעשו בהתאם להנחיות ולפרוטוקול שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של SingHealth (IACUC) והצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. הגורים עברו דיכוי חיסוני מ-P17 (לפני ההשתלה) ל-P30 (לאחר ההשתלה) על ידי האכלתם במי שתייה המכילים צ.......

Discussion

ההזרקה התת-רשתית שימשה להשתלת תרחיף תאים לטיפול ב-RPE ובמחלות רשתית 23,25,26,27,28,31,40. גישה זו חיונית ביותר במחקרי מכרסמים לא רק עבור השתלות תאים וגישות ריפוי גנטי, אלא ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36