Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Описан подробный протокол подготовки посткриоконсервированных клеток-предшественников фоторецепторов hESC и субретинальной доставки этих клеток у мышей rd10 .

Abstract

Регенерация фоторецепторных клеток с помощью плюрипотентных стволовых клеток человека является перспективной терапией для лечения как наследственных, так и возрастных заболеваний сетчатки на поздних стадиях. Мы показали, что человеческий рекомбинантный матрица изоформы ламинина, специфичная для сетчатки, способна поддерживать дифференцировку эмбриональных стволовых клеток человека (чЭСК) в прогениторы фоторецепторов. Кроме того, субретинальная инъекция этих клеток также показала частичное восстановление на моделях грызунов и кроликов rd10 . Субретинальная инъекция, как известно, является признанным методом, который используется для доставки фармацевтических соединений в фоторецепторные клетки и слой пигментного эпителия сетчатки (RPE) глаза из-за его близости к целевому пространству. Он также используется для доставки аденоассоциированных вирусных векторов в субретинальное пространство для лечения заболеваний сетчатки. Субретинальная доставка фармацевтических соединений и клеток в мышиной модели затруднена из-за ограничений в размере мышиного глазного яблока. В этом протоколе подробно описана процедура подготовки клеток-предшественников фоторецепторов, полученных из hESC, для инъекции и методика субретинальной доставки этих клеток у мышей с мутацией генетического пигментного ретинита, rd10 . Такой подход позволяет проводить клеточную терапию в целевой области, в частности во внешнем ядерном слое сетчатки, где происходят заболевания, приводящие к дегенерации фоторецепторов.

Introduction

Наследственные заболевания сетчатки и возрастная макулярная дегенерация приводят к потере фоторецепторных клеток и, в конечном итоге, к слепоте. Фоторецептор сетчатки представляет собой наружный сегментный слой сетчатки, состоящий из специализированных клеток, ответственных за фототрансдукцию (т.е. преобразование света в нейронные сигналы). Палочковидные и колбочковые фоторецепторные клетки примыкают к пигментному слою сетчатки (РПЭ)1. Заместительная терапия фоторецепторными клетками для компенсации потери клеток является новым и развивающимся терапевтическим подходом. Для восстановления поврежденных фоторецепторных клеток использовали эмбриона....

Protocol

Эксперименты in vivo проводились в соответствии с руководящими принципами и протоколом, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных SingHealth (IACUC) и Заявлением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и.......

Representative Results

Стеклянный шприц объемом 10 мкл был собран в соответствии с инструкциями производителя (рис. 1), а тупая игла, используемая для подачи клеточной суспензии/среды, показана на рисунке 1B. Различные подходы к субретинальной инъекции проиллюстрированы на

Discussion

Субретинальная инъекция была использована для трансплантации клеточной суспензии для лечения РПЭ и заболеваний сетчатки 23,25,26,27,28,31,40. Этот подход очень важен .......

Disclosures

Хви Гун Тай является соучредителем компании Alder Therapeutics AB. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgements

Мы благодарим Вэй Шэн Тана, Луанн Чан, Сюэ Йена, Синьи Ли и Инин Чунг за оказанную техническую помощь в подготовке фоторецепторов-предшественников на 32-й день после криоконсервации. Эта работа была частично поддержана грантами Национального совета по медицинским исследованиям (NMRC/OFYIRG/0042/2017) и грантом24-й конкурсной исследовательской программы Национального исследовательского фонда (CRP24-2020-0083) для H.G.T.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.3% TobramycinNovartisNDC  0078-0813-01Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% DexamethasoneNovartisNDC 0078-0876-01Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochlorideAlconNDC 0998-0016-150.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringeTuremoSS01T2713
1% TropicamideAlconNDC 0998-0355-151% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochlorideAlconNDC 0998-0342-052.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plateCostar3526
30 G Disposable needleBecton Dickinson (BD)305128
33 G, 20 mm length blunt needlesHamilton7803-05
Automated Cell CounterNanoEnTekModel: Eve
B27 without Vitamin ALife Technologies125870012%36
BuprenorphineCevaVetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7SigmaC07425 µM36
CyclosporineNovartis260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cellsDUKE-NUS Medical SchoolHuman embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
GauzeWinner Industries Co. Ltd.1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential MediumGibco11710–035
hESC cell line H1WiCell Research InstituteWA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02-5010 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)Prospec-Tany TechnogeneCYT-27210 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)Ceva Santé AnimaleKETALAB03
LN-521BiolaminaLN521-021 µg36
mFreSRSTEMCELL Technologies5854
Microlitre glass syringe (10 mL)Hamilton7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)SelleckchemS221510 µM36
N-2 supplementLife TechnologiesA13707-011%36
Non-essential amino acids (NEAA)Gibco11140–0501x36
NutriStem XF MediaSatorius05-100-1A
Operating microscopeZeissOPMI LUMERA 700With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)DUKE-NUS Medical SchoolSee media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
PyruvateGibco11360–0701 mM36
Rd10 miceJackson LaboratoryB6.CXB1-Pde6brd10/J miceGender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g 
Retinoic acidTocris Bioscience0695/500.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
SB431542SigmaS43170.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)Troy LaboratoriesLI0605
β-mercaptoethanolLife Technologies21985–0230.1 mM36

References

  1. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  2. Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Rd10RPE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved