A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול ניסיוני זה מתאר ומייעל שיטת צביעה של אימונוהיסטוכימיה מרובת אולמים (IHC), בעיקר על ידי אופטימיזציה של תנאי דגירה של נוגדנים חד-ערוציים והתאמת ההגדרות של נוגדנים ותעלות לפתרון בעיות של אוטופלואורסנציה ותקשורת צולבת ערוצים ברקמות סרטן ריאות ממוצא קליני.
סרטן הריאה הוא הגורם המוביל לתחלואה ותמותה מגידולים ממאירים בכל רחבי העולם, והמיקרו-סביבה המורכבת של הגידול נחשבת לסיבת המוות המובילה בקרב חולי סרטן ריאה. המורכבות של המיקרו-סביבה של הגידול דורשת שיטות יעילות להבנת יחסי תא-תא ברקמות הגידול. טכניקת האימונוהיסטוכימיה המרובבת (mIHC) הפכה לכלי מפתח להסקת הקשר בין ביטוי חלבונים במעלה ובמורד הזרם של מסלולי איתות ברקמות הגידול לבין פיתוח אבחנות קליניות ותוכניות טיפול. mIHC היא שיטת צביעה אימונופלואורסצנטית מרובת תוויות המבוססת על טכנולוגיית הגברת אות טיראמין (TSA), שיכולה לזהות בו זמנית מולקולות מטרה מרובות על אותה דגימת מקטע רקמה כדי להשיג ביטוי משותף של חלבונים שונים וניתוח לוקליזציה משותפת. בפרוטוקול ניסויי זה, קטעי רקמה משובצים בפרפין של קרצינומה קשקשית ריאתית ממקור קליני היו נתונים לצביעה אימונוהיסטוכימית מרובה. על ידי אופטימיזציה של פרוטוקול הניסוי, הושגה צביעה אימונוהיסטוכימית מרובת משתתפים של תאי מטרה וחלבונים מסומנים, ופתר את בעיית האוטופלואורסצנטיות ושיחות הערוץ ברקמות הריאה. בנוסף, צביעה אימונוהיסטוכימית מרובת משתתפים נמצאת בשימוש נרחב בתיקוף ניסיוני של ריצוף הקשור לגידול, בתפוקה גבוהה, כולל ריצוף תא יחיד, פרוטאומיקה וריצוף חלל רקמות, ומספק תוצאות אימות פתולוגיות אינטואיטיביות וחזותיות.
הגברת אות טיראמין (TSA), שיש לה היסטוריה של יותר מ -20 שנה, היא קבוצה של טכניקות בדיקה המשתמשות בפרוקסידז חזרת (HRP) לתיוג צפיפות גבוהה באתרו של אנטיגני מטרה ומיושמת באופן נרחב בבדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISAs), הכלאה באתרו (ISH), אימונוהיסטוכימיה (IHC) וטכניקות אחרות לזיהוי אנטיגנים ביולוגיים, שיפור משמעותי ברגישות האות שזוהה1. צביעה פוליכרומטית אופל המבוססת על טכנולוגיית TSA פותחה לאחרונה ונמצאת בשימוש נרחב במספר מחקרים 2,3,4,5. צביעת אימונופלואורסנציה מסורתית (IF) מספקת לחוקרים כלי....
הפרוטוקול מאושר על ידי הנחיות ועדת האתיקה של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן, סין. דגימות רקמת סרטן הריאה התקבלו במהלך ניתוח במרכז לסרטן ריאות בבית החולים מערב סין, והתקבלה הסכמה מדעת מכל חולה.
1. הכנת מקטע רקמות
ביצענו אופטימיזציה של ערכת ההתאמה של נוגדנים ראשוניים CD8 ופלואורופורים. שתי קבוצות התוצאות הפלואורסצנטיות התאימו בדיוק לאותם תנאי דגירה של נוגדנים בקבוצת הניסוי, למעט השינוי בפלואורופור תואם הנוגדנים. כפי שניתן לראות באיור 2, היה הבדל משמעותי בהתאמת התעלה של תאי T CD8+ עם פל.......
mIHC היא טכניקה ניסיונית חיונית בתחום המחקר המדעי לניתוח כמותי ומרחבי של סמנים חלבוניים מרובים ברמת התא הבודד בקטע רקמה יחיד, המספק נתונים אינטואיטיביים ומדויקים לחקר פתולוגיה של מחלות על ידי התמקדות במבנה הרקמה המפורט ובאינטראקציות תאיות בהקשר של הרקמה המקורית. האימוץ הנרחב של טכנולוגיי.......
כל המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
המחברים רוצים להודות לחברי מכון המחקר לפתולוגיה קלינית בית החולים מערב סין, שתרמו הדרכה טכנית לאימונופלואורסנציה מולטיפלקס איכותית ועיבוד IHC. פרוטוקול זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82200078).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Anti-CD8 | Abcam | ab237709 | Primary antibody, 1/100, PH9 |
Anti-CD68 | Abcam | ab955 | Primary antibody, 1/300, PH9 |
Anti-CK5/6 | Millipore | MAB1620 | Primary antibody, 1/150, PH9 |
Anti-HMGCS1 | GeneTex | GTX112346 | Primary antibody, 1/300, PH6 |
Animal nonimmune serum | MXB Biotechnologies | SP KIT-B3 | Antigen blocking |
Fluormount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Anti-fluorescent burst |
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit | Akoya | NEL861001KT | Opal mIHC Staining |
Wash Buffer | Dako | K8000/K8002/K8007/K8023 | Washing the tissues slides |
Software | |||
HALO | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
inForm | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
PerkinElmer Vectra | multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides. | ||
QuPath 0.3.2 | intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved