צביעה אימונוהיסטוכימית מולטיפלקס לרקמת סרטן ריאות משובצת פרפין

Summary

פרוטוקול ניסיוני זה מתאר ומייעל שיטת צביעה של אימונוהיסטוכימיה מרובת אולמים (IHC), בעיקר על ידי אופטימיזציה של תנאי דגירה של נוגדנים חד-ערוציים והתאמת ההגדרות של נוגדנים ותעלות לפתרון בעיות של אוטופלואורסנציה ותקשורת צולבת ערוצים ברקמות סרטן ריאות ממוצא קליני.

Abstract

סרטן הריאה הוא הגורם המוביל לתחלואה ותמותה מגידולים ממאירים בכל רחבי העולם, והמיקרו-סביבה המורכבת של הגידול נחשבת לסיבת המוות המובילה בקרב חולי סרטן ריאה. המורכבות של המיקרו-סביבה של הגידול דורשת שיטות יעילות להבנת יחסי תא-תא ברקמות הגידול. טכניקת האימונוהיסטוכימיה המרובבת (mIHC) הפכה לכלי מפתח להסקת הקשר בין ביטוי חלבונים במעלה ובמורד הזרם של מסלולי איתות ברקמות הגידול לבין פיתוח אבחנות קליניות ותוכניות טיפול. mIHC היא שיטת צביעה אימונופלואורסצנטית מרובת תוויות המבוססת על טכנולוגיית הגברת אות טיראמין (TSA), שיכולה לזהות בו זמנית מולקולות מטרה מרובות על אותה דגימת מקטע רקמה כדי להשיג ביטוי משותף של חלבונים שונים וניתוח לוקליזציה משותפת. בפרוטוקול ניסויי זה, קטעי רקמה משובצים בפרפין של קרצינומה קשקשית ריאתית ממקור קליני היו נתונים לצביעה אימונוהיסטוכימית מרובה. על ידי אופטימיזציה של פרוטוקול הניסוי, הושגה צביעה אימונוהיסטוכימית מרובת משתתפים של תאי מטרה וחלבונים מסומנים, ופתר את בעיית האוטופלואורסצנטיות ושיחות הערוץ ברקמות הריאה. בנוסף, צביעה אימונוהיסטוכימית מרובת משתתפים נמצאת בשימוש נרחב בתיקוף ניסיוני של ריצוף הקשור לגידול, בתפוקה גבוהה, כולל ריצוף תא יחיד, פרוטאומיקה וריצוף חלל רקמות, ומספק תוצאות אימות פתולוגיות אינטואיטיביות וחזותיות.

Introduction

הגברת אות טיראמין (TSA), שיש לה היסטוריה של יותר מ -20 שנה, היא קבוצה של טכניקות בדיקה המשתמשות בפרוקסידז חזרת (HRP) לתיוג צפיפות גבוהה באתרו של אנטיגני מטרה ומיושמת באופן נרחב בבדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISAs), הכלאה באתרו (ISH), אימונוהיסטוכימיה (IHC) וטכניקות אחרות לזיהוי אנטיגנים ביולוגיים, שיפור משמעותי ברגישות האות שזוהה¹. צביעה פוליכרומטית אופל המבוססת על טכנולוגיית TSA פותחה לאחרונה ונמצאת בשימוש נרחב במספר מחקרים 2,3,4,5. צביעת אימונופלואורסנציה מסורתית (IF) מספקת לחוקרים כלי....

Protocol

הפרוטוקול מאושר על ידי הנחיות ועדת האתיקה של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן, סין. דגימות רקמת סרטן הריאה התקבלו במהלך ניתוח במרכז לסרטן ריאות בבית החולים מערב סין, והתקבלה הסכמה מדעת מכל חולה.

1. הכנת מקטע רקמות

1. הכנת FFPE
   1. לטבול רקמות קליניות בתמיסת פור.......

Discussion

mIHC היא טכניקה ניסיונית חיונית בתחום המחקר המדעי לניתוח כמותי ומרחבי של סמנים חלבוניים מרובים ברמת התא הבודד בקטע רקמה יחיד, המספק נתונים אינטואיטיביים ומדויקים לחקר פתולוגיה של מחלות על ידי התמקדות במבנה הרקמה המפורט ובאינטראקציות תאיות בהקשר של הרקמה המקורית. האימוץ הנרחב של טכנולוגיי.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Anti-CD8	Abcam	ab237709	Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68	Abcam	ab955	Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6	Millipore	MAB1620	Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1	GeneTex	GTX112346	Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum	MXB Biotechnologies	SP KIT-B3	Antigen blocking
Fluormount-G	SouthernBiotech	0100-01	Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit	Akoya	NEL861001KT	Opal mIHC Staining
Wash Buffer	Dako	K8000/K8002/K8007/K8023	Washing the tissues slides
Software
HALO			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm			intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra			multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2			intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.