Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול ניסיוני זה מתאר ומייעל שיטת צביעה של אימונוהיסטוכימיה מרובת אולמים (IHC), בעיקר על ידי אופטימיזציה של תנאי דגירה של נוגדנים חד-ערוציים והתאמת ההגדרות של נוגדנים ותעלות לפתרון בעיות של אוטופלואורסנציה ותקשורת צולבת ערוצים ברקמות סרטן ריאות ממוצא קליני.

Abstract

סרטן הריאה הוא הגורם המוביל לתחלואה ותמותה מגידולים ממאירים בכל רחבי העולם, והמיקרו-סביבה המורכבת של הגידול נחשבת לסיבת המוות המובילה בקרב חולי סרטן ריאה. המורכבות של המיקרו-סביבה של הגידול דורשת שיטות יעילות להבנת יחסי תא-תא ברקמות הגידול. טכניקת האימונוהיסטוכימיה המרובבת (mIHC) הפכה לכלי מפתח להסקת הקשר בין ביטוי חלבונים במעלה ובמורד הזרם של מסלולי איתות ברקמות הגידול לבין פיתוח אבחנות קליניות ותוכניות טיפול. mIHC היא שיטת צביעה אימונופלואורסצנטית מרובת תוויות המבוססת על טכנולוגיית הגברת אות טיראמין (TSA), שיכולה לזהות בו זמנית מולקולות מטרה מרובות על אותה דגימת מקטע רקמה כדי להשיג ביטוי משותף של חלבונים שונים וניתוח לוקליזציה משותפת. בפרוטוקול ניסויי זה, קטעי רקמה משובצים בפרפין של קרצינומה קשקשית ריאתית ממקור קליני היו נתונים לצביעה אימונוהיסטוכימית מרובה. על ידי אופטימיזציה של פרוטוקול הניסוי, הושגה צביעה אימונוהיסטוכימית מרובת משתתפים של תאי מטרה וחלבונים מסומנים, ופתר את בעיית האוטופלואורסצנטיות ושיחות הערוץ ברקמות הריאה. בנוסף, צביעה אימונוהיסטוכימית מרובת משתתפים נמצאת בשימוש נרחב בתיקוף ניסיוני של ריצוף הקשור לגידול, בתפוקה גבוהה, כולל ריצוף תא יחיד, פרוטאומיקה וריצוף חלל רקמות, ומספק תוצאות אימות פתולוגיות אינטואיטיביות וחזותיות.

Introduction

הגברת אות טיראמין (TSA), שיש לה היסטוריה של יותר מ -20 שנה, היא קבוצה של טכניקות בדיקה המשתמשות בפרוקסידז חזרת (HRP) לתיוג צפיפות גבוהה באתרו של אנטיגני מטרה ומיושמת באופן נרחב בבדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISAs), הכלאה באתרו (ISH), אימונוהיסטוכימיה (IHC) וטכניקות אחרות לזיהוי אנטיגנים ביולוגיים, שיפור משמעותי ברגישות האות שזוהה1. צביעה פוליכרומטית אופל המבוססת על טכנולוגיית TSA פותחה לאחרונה ונמצאת בשימוש נרחב במספר מחקרים 2,3,4,5. צביעת אימונופלואורסנציה מסורתית (IF) מספקת לחוקרים כלי....

Protocol

הפרוטוקול מאושר על ידי הנחיות ועדת האתיקה של בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ'ואן, סין. דגימות רקמת סרטן הריאה התקבלו במהלך ניתוח במרכז לסרטן ריאות בבית החולים מערב סין, והתקבלה הסכמה מדעת מכל חולה.

1. הכנת מקטע רקמות

  1. הכנת FFPE
    1. לטבול רקמות קליניות בתמיסת פור.......

Representative Results

ביצענו אופטימיזציה של ערכת ההתאמה של נוגדנים ראשוניים CD8 ופלואורופורים. שתי קבוצות התוצאות הפלואורסצנטיות התאימו בדיוק לאותם תנאי דגירה של נוגדנים בקבוצת הניסוי, למעט השינוי בפלואורופור תואם הנוגדנים. כפי שניתן לראות באיור 2, היה הבדל משמעותי בהתאמת התעלה של תאי T CD8+ עם פל.......

Discussion

mIHC היא טכניקה ניסיונית חיונית בתחום המחקר המדעי לניתוח כמותי ומרחבי של סמנים חלבוניים מרובים ברמת התא הבודד בקטע רקמה יחיד, המספק נתונים אינטואיטיביים ומדויקים לחקר פתולוגיה של מחלות על ידי התמקדות במבנה הרקמה המפורט ובאינטראקציות תאיות בהקשר של הרקמה המקורית. האימוץ הנרחב של טכנולוגיי.......

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לחברי מכון המחקר לפתולוגיה קלינית בית החולים מערב סין, שתרמו הדרכה טכנית לאימונופלואורסנציה מולטיפלקס איכותית ועיבוד IHC. פרוטוקול זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82200078).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Anti-CD8Abcamab237709Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68Abcamab955Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6MilliporeMAB1620Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1GeneTexGTX112346Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serumMXB BiotechnologiesSP KIT-B3Antigen blocking
Fluormount-GSouthernBiotech0100-01Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC KitAkoyaNEL861001KTOpal mIHC Staining
Wash BufferDakoK8000/K8002/K8007/K8023Washing the tissues slides
Software
HALOintelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inFormintelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectramultispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.

References

  1. Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).
  2. Lovisa, S., et al.

Explore More Articles

JoVE201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved