이 연구는 중국 자연과학재단(82070450 to C.T.and 82170466 to L.Z.)과 중국 박사후 과학 재단(China Postdoctoral Science Foundation)의 펠로우십(7121102223 to F.L.)의 보조금으로 지원되었습니다.

아래에 설명된 모든 동물 시술은 Soochow University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다.
1. 시약 및 재료 준비
<ol><li>칼슘과 마그네슘이 없는 1x PBS와 2.5U/mL 헤파린 나트륨염을 사용하여 관류 용액을 준비합니다. 4 °C에서 보관하고 사용 시 얼음에서 예식하십시오.</li>
	<li>1250 CDU/mL 콜라겐분해효소 II 및 3000 U/mL DNase I을 HBSS로 희석하여 125 CDU/mL 콜라...

Two-Step Cell Digestion of Mouse Carotid Artery

<ol>
	<li>Lee, D. -. Y., Chiu, J. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis+and+flow:+roles+of+epigenetic+modulation+in+vascular+endothelium.">Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium.</a> Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56 (2019).</li><li>Libby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis.">Atherosclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56 (2019).</li><li>Jovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+applications:+A+brief+overview.">Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview.</a> Clinical and Translational Medicine. 12 (3), e694 (2022).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Rohlenova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+maps+endothelial+metabolic+plasticity+in+pathological+angiogenesis.">Single-cell RNA sequencing maps endothelial metabolic plasticity in pathological angiogenesis.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 862.e14-877.e14 (2020).</li><li>Ren, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+gained+from+single-cell+analysis+of+immune+cells+in+the+tumor+microenvironment.">Insights gained from single-cell analysis of immune cells in the tumor microenvironment.</a> Annual Review of Immunology. 39, 583-609 (2021).</li><li>Sun, H., Xu, X., Deng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single+epithelial+cells+suspension+from+mouse+mammary+glands.">Preparation of single epithelial cells suspension from mouse mammary glands.</a> Bio-Protocol. 10 (4), e3530 (2020).</li><li>Korin, B., Chung, J. -. J., Avraham, S., Shaw, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+of+mouse+glomeruli+for+high-throughput+analysis.">Preparation of single-cell suspensions of mouse glomeruli for high-throughput analysis.</a> Nature Protocols. 16 (8), 4068-4083 (2021).</li><li>Thomson, B., Quaggin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+single+cell+suspension+from+the+murine+iridocorneal+angle.">Preparation of a single cell suspension from the murine iridocorneal angle.</a> Bio-Protocol. 12 (10), e4426 (2022).</li><li>Leale, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-stage+digestion+of+whole+murine+knee+joints+for+single-cell+RNA+sequencing.">A two-stage digestion of whole murine knee joints for single-cell RNA sequencing.</a> Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (4), 100321 (2022).</li><li>Hu, D., Yin, C., Mohanta, S. K., Weber, C., Habenicht, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+aorta.">Preparation of single-cell suspensions from mouse aorta.</a> Bio-Protocol. 6 (11), e1832 (2016).</li><li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+dissociator.">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. 29, e1266 (2009).</li><li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+UMI-based+single-cell+RNA-seq+preprocessing+workflows.">Benchmarking UMI-based single-cell RNA-seq preprocessing workflows.</a> Genome Biology. 22 (1), 339 (2021).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Depuydt, M. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+of+the+human+atherosclerotic+plaque+by+single-cell+transcriptomics.">Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics.</a> Circulation Research. 127 (11), 1437-1455 (2020).</li><li>Gao, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+of+the+rat+carotid+arteries+uncovers+potential+cellular+targets+of+neointimal+hyperplasia.">Single-cell RNA sequencing of the rat carotid arteries uncovers potential cellular targets of neointimal hyperplasia.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 75152 (2021).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+the+lumen+of+mouse+carotid+arteries+for+single-cell+multi-omics+experiments.">Isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 176, e63128 (2021).</li></ol>

여기에서는 야생형 마우스의 경동맥에서 콜라겐분해효소/DNase 및 트립신의 소화 과정을 통합하는 2단계 소화 방법을 구축한 고품질 단세포 현탁액을 제조하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 단일 세포 현탁액의 품질 검사 후, 우리는 그것이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 시퀀싱에 대한 요구 사항을 충족한다는 것을 발견했습니다. 또한 VSMC, 섬유아세포, EC 및 Mφ/DC를 ...

죽상동맥경화증은 고혈압, 고지혈증, 혈류역학 등의 위험인자와 관련된 만성 염증성 질환이다1. 경동맥 분기는 혈역학적 변화가 일어나기 쉬우며 경동맥 플라크 형성을 유발합니다. 경동맥 죽상동맥경화증의 임상적 양상은 뇌졸중, 일과성 뇌허혈과 같은 급성일 수도 있고, 재발성 일과성 뇌허혈, 혈관성 치매와 같은 만성일 수도 있다2. 기계적으로 경동맥 플라크는 병리학적 조건에서 서로 다른 혈관 벽 세포와 다양한 혈액 세포 간의 상호 작용의 결과입니다. 따라서 생리학적 및 병리학적 조건에서 경동맥의 단세포 아틀라스를 밝히는 것은 경동맥 플라크 발생을 예방하고 치료하는 데 특히 중요합니다.
단일 세포 RNA 염기서열 분석은 초고분해능과 동일한 세포 유형의 유기체에서 세포 이질성을 검출하기 때문에 생물학 연구의 가장 강력한 기술중 하나입니다 3,4. 연구자들은 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 사용하여 심혈관 질환5 및 암6과 같은 많은 분야에서 연구를 수행했습니다. 그러나 조직을 단일 세포로 빠르고 정확하게 분리하는 것은 여전히 주요 과제 중 하나입니다. 효소 해리는 콜라겐분해효소, 파파인, 트립신, DNase 및 히알루로니다아제를 주로 포함하는 일반적으로 사용되는 방법입니다. 특히, 콜라겐분해효소는 단세포 소화를 위한 주요 효소 종으로, 주로 결합 조직의 콜라겐 성분을 가수분해합니다. 다양한 콜라겐분해효소 유형은 유선7, 사구체8, 홍채각9, 무릎관절10, 대동맥11, 폐12와 같은 다양한 조직의 해리에 적용할 수 있다. 서로 다른 조직의 고유한 생리학적 특성으로 인해 동일한 방법을 사용한 해리는 낮은 세포 생존율, 낮은 세포 수 및 큰 세포 파편과 같은 단일 세포를 획득하는 데 많은 문제를 일으킬 수 있습니다. 그러므로, 상이한 조직에 대한 분해 방법의 발명은 고품질 단세포 현탁액을 제조하는 데 필수적이다.
이 프로토콜은 야생형 마우스의 경동맥의 단세포 현탁액을 제조하기 위한 2단계 세포 분해 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 경동맥의 특성에 따라 콜라겐분해효소/DNase와 트립신을 결합하여 생쥐 경동맥의 고품질 단세포 현탁액을 얻었는데, 이는 콜라겐분해효소가 경동맥 조직의 콜라겐을 가수분해할 수 있기 때문이며, 이는 트립신에 의해 단세포 현탁액으로 더 소화되었습니다. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) 이중 형광 계수를 사용하여 세포 생존율과 농도를 검출했으며, 단일 세포 현탁액이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 염기서열 분석 요구 사항을 충족하는 것으로 나타났습니다. 단일 세포 데이터 처리 후 소화 후 정상 마우스 경동맥에서 혈관 평활근 세포(VSMC), 섬유아세포, 내피 세포(EC), 대식세포 및 수지상 세포(Mφ/DC)를 포함한 4가지 세포 유형이 확인되었습니다. 이 프로토콜의 장점은 1) 경동맥의 여러 세포 유형을 식별할 수 있고, 2) 세포 생존율이 잘 보존되며, 3) 특별한 장비 없이 쉽게 반복할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 마우스 경동맥의 단세포 다중체학 연구에 관심이 있는 연구자에게 적합합니다. 이 프로토콜은 적절한 변형을 통해 다른 혈관을 해리하는 데에도 도움이 될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% EDTA-free trypsin</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0205</td>
			<td>Dilute 1 mL of 0.25% EDTA-free trypsin into 1 mL of 1x PBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% NaCl saline solution</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST341</td>
			<td>Dilute the heparin sodium solution into a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>&#160;SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r009</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211W</td>
			<td>To centrifuge the tissue piece and cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>SKJYLEAN</td>
			<td>sk-r013</td>
			<td>To perform cardiac perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m cell strainer</td>
			<td>JETBIOFIL</td>
			<td>css010040</td>
			<td>To filter undigested tissue fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI kit</td>
			<td>Hengrui Biological</td>
			<td>RE010212</td>
			<td>To identify whether the cell is alive or dead</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>Countstar</td>
			<td>Mira FL</td>
			<td>To analyze the cell morphology and cell viability of digested carotid vascular cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger software</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>3.0.2</td>
			<td>To process Chromium single-cell RNA-seq output and perform clustering and gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Single Cell 3&#39;Reagent Kits v3</td>
			<td>10&#215; Genomics</td>
			<td>1000075</td>
			<td>To prepare single-cell RNA-seq libraries of single-cell suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 125 CDU/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>Dilute with HBSS to a final concentration of 60 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30088.03</td>
			<td>Termination of the digestion reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td>Store at the room temperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>H8060</td>
			<td>Dilute with 0.9% NaCl to a final concentration of 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002560</td>
			<td>Applied for spining down the tissues and cell pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NovaSeq 6000&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Sequencer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio Life Science</td>
			<td>P1000</td>
			<td>Used for cardiac perfusion and resuspension of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat package- R</td>
			<td>Satija Lab</td>
			<td>3.1.2</td>
			<td>To performed dimensionality reduction, visualization, and analysis of scRNA-sequencing data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Six-well cell culture plates</td>
			<td>NEST</td>
			<td>703002</td>
			<td>Place the vascular tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>DK-S22</td>
			<td>Keep the digestion temperature at 37 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of a single-cell suspension from mouse carotid arteries for single-cell sequencing

경동맥은 뇌에 혈액과 산소를 공급하는 목의 주요 혈관이지만, 경동맥 협착증은 플라크로 경동맥이 막힐 때 발생합니다. 단세포 수준에서 경동맥의 세포 구성을 밝히는 것은 경동맥 죽상동맥경화증 치료에 필수적입니다. 그러나 경동맥에서 단세포 현탁액을 제조하기 위해 즉시 사용할 수 있는 프로토콜은 없습니다. 세포 손상을 줄이면서 단세포 수준에서 정상 경동맥을 해리하는 데 적합한 프로토콜을 얻기 위해 콜라겐분해효소/DNase와 트립신의 분해 과정을 통합하여 2단계 소화 방법을 설계했습니다. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) 이중 형광 계수를 사용하여 세포 생존율과 농도를 검출했으며, 단일 세포 현탁액이 85% 이상의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 염기서열 분석 요구 사항을 충족하는 것으로 나타났습니다. 단일 세포 데이터 처리 후 각 경동맥 세포에서 세포당 ~2500개의 전사체 중앙값이 검출되었습니다. 특히, 혈관 평활근 세포(VSMC), 섬유아세포, 내피세포(EC), 대식세포 및 수지상세포(Mφ/DC)를 포함한 정상 경동맥의 다양한 세포 유형이 동시에 검출되었습니다. 이 프로토콜은 적절한 변형을 갖는 다른 조직으로부터의 혈관의 단세포 현탁액을 제조하기 위해 적용될 수 있다.

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease associated with risk factors such as high blood pressure, hyperlipidemia, and hemodynamics1. Carotid artery bifurcations are prone to hemodynamic changes and lead to carotid plaque formation. The clinical presentation of carotid atherosclerosis can be acute such as stroke and transient cerebral ischemia, or chronic such as recurrent transient cerebral ischemia and vascular dementia2. Mechanically, carotid plaque is the outcome of the interaction between different vessel wall cells and various blood cells under pathological conditions. Therefore, revealing the single-cell atlas of carotid vessels under physiological and pathological conditions is particularly important for preventing and treating carotid plaque development.
Single-cell RNA sequencing is one of the most powerful technologies of biological research because of its ultrahigh resolution and detection of cell heterogeneity from the same cell type of organisms3,4. Researchers have used single-cell RNA sequencing to conduct research in many fields, such as cardiovascular disease5 and cancer6. However, quickly and accurately separating tissues into single cells is still one of the main challenges. Enzymatic dissociation is a commonly used method that dominantly includes collagenase, papain, trypsin, DNase, and hyaluronidase. Specifically, collagenases are the major enzyme species for single-cell digestion, mainly hydrolyzing collagen components in connective tissues. Different collagenase types are applicable for the dissociation of different tissues, such as the mammary gland7, glomerulus8, iridocorneal angle9, knee joint10, aorta11, and lung12. Due to the unique physiological properties of different tissues, dissociation using the same method may cause many troubles in acquiring single cells, such as low cell viability, low cell number, and large cell debris. Therefore, the invention of digestion methods for different tissues is essential for preparing high-quality single-cell suspensions.
This protocol aims to develop a two-step cell digestion method to prepare a single-cell suspension of the carotid artery of wild-type mice. According to the characteristics of the carotid artery, we combined collagenase/DNase with trypsin to obtain a high-quality single-cell suspension of the mouse carotid artery because collagenase can hydrolyze collagen of the carotid tissues, which was further digested by trypsin into a single-cell suspension. Acridine orange/propidium iodide (AO/PI) dual-fluorescence counting was used to detect cell viability and concentration, and it was found that the single-cell suspension satisfied the requirements for single-cell sequencing, with the viability of cells over 85% and a high cell concentration. After single-cell data processing, four cell types, including vascular smooth muscle cells (VSMCs), fibroblasts, endothelial cells (ECs), and macrophages and dendritic cells (M&#966;/DCs), were identified in normal mouse carotid arteries after digestion. The advantages of this protocol are that: 1) multiple cell types in the carotid artery can be identified, 2) cell viability is well preserved, and 3) it can be easily repeated without special equipment. This protocol is suitable for researchers who are interested in studying single-cell multiomics of the mouse carotid arteries. This protocol may also be helpful in the dissociation of other blood vessels with appropriate modifications.

Author Spotlight: Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy 

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

이 프로토콜은 마우스 경동맥의 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 2단계 세포 분해 방법을 설명합니다(그림 1). 이 2단계 세포 분해 방법은 콜라겐분해효소/DNase와 트립신을 결합하여 쥐 경동맥 혈관벽을 효과적으로 해리하여 단일 세포 염기서열 분석을 위한 고품질 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 해리 후, 세포 농도 및 세포 생존율은 자동화된 세포 카운터에 의해 계산되었?...

Watch this Scientific Journal Video about Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy at JoVE.com

여기서는 마우스 경동맥의 단세포 현탁액을 준비하기 위한 2단계 세포 분해 프로토콜을 설명합니다.

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...

낮은 용해도와 더 큰 세포 디브리핑은 혈관 조직 해리의 주요 어려움입니다. 당사의 2단계 또는 분해 방법은 경동맥 조직 해리에 매우 적합하며 경미한 변형이 있는 다른 혈관에 대한 단세포 의심을 준비하는 데 사용할 수 있어 심혈관 연구에 매우 도움이 됩니다. 이 프로토콜은 경동맥에서 여러 세포 유형을 얻는 데 적합하며 특별한 장비 없이 쉽게 반복할 수 있습니다.앞으로는 단세포 이온 염기서열 분석으로 발견한 세포 서브클래스를 심혈관 질환의 표적 치료에 사용하는 것을 목표로 하고 있습니다.