עיבוד רקמות ובידוד פיברובלסטים ראשוניים מהנרתיק האנושי

Summary

פרוטוקול זה מדגים טכניקה אמינה ויעילה לבידוד פיברובלסטים ראשוניים מרקמת הנרתיק האנושית לפני גיל המעבר או לאחר גיל המעבר. הפרוטוקולים הקיימים לבידוד פיברובלסטים בנרתיק אינם לוקחים בחשבון את האתגרים של בידוד תאים מרקמה מזדקנת. רקמת הנרתיק התקבלה מנשים לאחר ניתוח צניחת איברי האגן.

Abstract

צניחת איברי האגן היא הפרעה המשפיעה קשות על איכות החיים של נשים. זה קורה כאשר השרירים והרצועות נחלשים וגורמים לאיברי האגן לרדת נמוך יותר באגן, יצירת בליטה בנרתיק. ניתוח לתיקון צניחת איברי האגן היה טיפול עיקרי. לאחרונה גובר העניין בחקר הרכב הרקמה של חולים עם צניחה ברמה התאית.

כיום אין הסכמה לגבי ההשפעה של גיל התורם או המטופל על טיפולים מבוססי תאים. הפרוטוקולים הנוכחיים שפורסמו לבידוד פיברובלסטים בנרתיק מתרכזים ברקמה לפני גיל המעבר או מזניחים את ההערה על גיל הרקמה התורמת. רוב הפרוטוקולים הקיימים משתמשים במודלים של בעלי חיים. העקביות של רקמת הנרתיק האנושית צפופה יותר מהרקמות המשמשות ברוב הפרוטוקולים. במחקר זה, רקמת נרתיק אנושית הושגה בעיקר מתורמים מבוגרים, מה שככל הנראה תרם לכישלון הפרוטוקולים הקיימים.

מטרת מחקר זה היא לתאר פרוטוקול סטנדרטי לרכישה אמינה של פיברובלסטים נרתיקיים אנושיים, ללא קשר לגיל התורם ולמצב גיל המעבר. התוצאות שוחזרו באמצעות רקמות מתשעה תורמים נפרדים שעברו ניתוח לצניחת איברי האגן. שש מטופלות היו לאחר גיל המעבר, כאשר התורמת המבוגרת ביותר הייתה בת 78. הגיל החציוני של תורמי הרקמה היה 59.

במאמר זה אנו מתארים שיטה אמינה ליצירת תרחיף חד-תאי מועשר בפיברובלסטים באמצעות שילוב של דיסוציאציה אנזימטית ומכנית ואיגום תרחיף תאי של ביופסיות נרתיקיות מרובות מתורם יחיד. בידוד אמין של פיברובלסטים ראשוניים בנרתיק האנושי עשוי להיות שימושי בחקר צניחת איברי האגן, כמו גם אינטראקציות מיקרוביום-מארח.

Introduction

פער מגדרי במדע ובמחקר הוא נושא מתמשך. מחקר על הפרעות המשפיעות בעיקר על אנשים ממין נשי אינו ממומן¹. צניחת איברי האגן היא הפרעה הקשורה מאוד למין הנשי. זה קורה כאשר השרירים והרצועות נחלשים וגורמים לאיברי האגן לרדת נמוך יותר באגן, יצירת בליטה בנרתיק². מעט ידוע על אינטראקציות תאיות בהקשר של פתופיזיולוגיה זו, וגם לא כיצד גורמים ברמת הרקמה משפיעים על הצלחת התערבויות כירורגיות³.

תאים ראשוניים ולא קווי תאים מוכרים באופן נרחב כחיוניים למחקר קליני תרגומי במתן רלוונטיות פיזיולוגית רבה יותר⁴. תאים ראשוניים נלקחים ישירות מרקמת....

Protocol

רקמת הנרתיק התקבלה מנשים שעברו ניתוח צניחת איברי האגן. רקמת הנרתיק שנאספה לאחר הניתוח נחשבה לחומר פסולת ואחרת הייתה מושלכת לפח. המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות ואושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית של מסצ'וסטס גנרל בריגהם.

1. קצירת רקמת הנרתיק מהמטופלת

Discussion

מחקרים קודמים רבים דיווחו כיצד לבודד פיברובלסטים ראשוניים מהנרתיק האנושי ^3,7. מספר מחקרים השתמשו ברקמת נרתיק אנושית מאנשים לפני גיל המעבר עם צניחת איברי האגן. למרות שכמה מאמרים דיווחו על שימוש ברקמה מאנשים לפני גיל המעבר ולאחר גיל המעבר

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Bio Techne	B23192
Cell strainer (100 μm)	ThermoFisher Scientific	22363549
Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Fisher Scientific	14-959-53A
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033
Feather Disposable Scalpel No. 15	Socorex	FB.15
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	NC1983075
High Clarity Conical Centrifuge Tubes (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
HulaMixer Sample Mixer	ThermoFisher Scientific	15920D
Human Fibronectin DuoSet ELISA	R&D Systems	DY1918-05
Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY6220-05
Liberase Research Grade	Sigma Aldrich	05 401 119 001
Penicillin/Streptomycin (5000U/ml)	ThermoFisher Scientific	15070063
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 20 mm)	Millipore Sigma	P5606
Serologic pipettes (10 mL)	ThermoFischer Scientific	170356N
Sterile syringes (5 mL)	Fischer Scientific	14-955-458