Processamento de tecidos e isolamento de fibroblastos primários da vagina humana

Summary

Este protocolo demonstra uma técnica confiável e eficaz para isolar fibroblastos primários do tecido vaginal humano na pré-menopausa ou na pós-menopausa. Os protocolos existentes para isolamento de fibroblastos vaginais não consideram os desafios do isolamento celular do tecido senescente. O tecido vaginal foi obtido de mulheres após cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos.

Abstract

O prolapso de órgãos pélvicos é um distúrbio que afeta seriamente a qualidade de vida das mulheres. Ocorre quando músculos e ligamentos enfraquecem e fazem com que os órgãos pélvicos caiam mais baixo na pelve, criando uma protuberância na vagina. A cirurgia para corrigir o prolapso dos órgãos pélvicos tem sido um tratamento básico. Recentemente, tem havido um interesse crescente em estudar a composição tecidual de pacientes com prolapso no nível celular.

Atualmente, há pouco consenso sobre o efeito da idade do doador ou do paciente nas terapias baseadas em células. Os protocolos atuais publicados para isolamento de fibroblastos vaginais concentram-se no tecido pré-menopausa ou negligenciam comentar sobre a idade do tecido do doador. A maioria dos protocolos existentes usa modelos animais. A consistência do tecido vaginal humano é mais densa do que os tecidos usados na maioria dos protocolos. Neste estudo, o tecido vaginal humano foi obtido principalmente de doadores mais velhos, o que provavelmente contribuiu para a falha dos protocolos existentes.

O objetivo deste estudo é descrever um protocolo padrão para a aquisição confiável de fibroblastos vaginais humanos, independentemente da idade da doadora e do status da menopausa. Os resultados foram reproduzidos usando tecido de nove doadores separados que foram submetidos à cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. Seis pacientes estavam na pós-menopausa, sendo que a doadora mais velha tinha 78 anos. A idade média dos doadores de tecidos foi de 59 anos.

Aqui, descrevemos um método confiável para gerar uma suspensão unicelular enriquecida com fibroblastos usando uma combinação de dissociação enzimática e mecânica e agrupamento de suspensão celular de várias biópsias vaginais de um único doador. O isolamento confiável de fibroblastos primários vaginais humanos pode ser útil no estudo do prolapso de órgãos pélvicos, bem como nas interações microbioma-hospedeiro.

Introduction

A disparidade de gênero na ciência e na pesquisa é um problema contínuo. A pesquisa sobre distúrbios que afetam principalmente pessoas do sexo feminino é subfinanciada¹. O prolapso de órgãos pélvicos é um distúrbio fortemente associado ao sexo feminino. Ocorre quando músculos e ligamentos enfraquecem e fazem com que os órgãos pélvicos caiam mais baixo na pelve, criando uma protuberância na vagina². Pouco se sabe sobre as interações celulares no contexto dessa fisiopatologia, nem como os fatores no nível do tecido afetam o sucesso das intervenções cirúrgicas³.

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Protocol

O tecido vaginal foi obtido de mulheres submetidas à cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. O tecido vaginal coletado após a cirurgia foi considerado resíduo e seria descartado. O estudo foi realizado em conformidade com as diretrizes institucionais e foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Massachusetts General Brigham.

1. Colheita de tecido vaginal do paciente

1. Diagnostique o prolapso de órgãos pélvicos fa.......

Discussion

Muitos estudos anteriores relataram como isolar fibroblastos primários da vagina humana ^3,7. Vários estudos usaram tecido vaginal humano de indivíduos na pré-menopausa com prolapso de órgãos pélvicos. Embora alguns trabalhos relatem o uso de tecido de indivíduos na pré-menopausa e na pós-menopausa ^7,11, eles não descrevem com detalhes suficientes o protocolo us.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Bio Techne	B23192
Cell strainer (100 μm)	ThermoFisher Scientific	22363549
Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Fisher Scientific	14-959-53A
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033
Feather Disposable Scalpel No. 15	Socorex	FB.15
Fetal Bovine Serum	Sigma Aldrich	NC1983075
High Clarity Conical Centrifuge Tubes (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
HulaMixer Sample Mixer	ThermoFisher Scientific	15920D
Human Fibronectin DuoSet ELISA	R&D Systems	DY1918-05
Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY6220-05
Liberase Research Grade	Sigma Aldrich	05 401 119 001
Penicillin/Streptomycin (5000U/ml)	ThermoFisher Scientific	15070063
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 20 mm)	Millipore Sigma	P5606
Serologic pipettes (10 mL)	ThermoFischer Scientific	170356N
Sterile syringes (5 mL)	Fischer Scientific	14-955-458