Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

Summary

Este protocolo apresenta um modelo tumor-on-a-chip fisiologicamente relevante para realizar pesquisa básica e translacional de câncer humano de alto rendimento, rastreamento avançado de drogas, modelagem de doenças e abordagens de medicina personalizada com uma descrição de procedimentos de carregamento, manutenção e avaliação.

Abstract

A falta de modelos de câncer validados que recapitulem o microambiente tumoral de cânceres sólidos in vitro continua sendo um gargalo significativo para a pesquisa pré-clínica do câncer e o desenvolvimento terapêutico. Para superar esse problema, desenvolvemos o microtumor vascularizado (VMT), ou chip tumoral, um sistema microfisiológico que modela realisticamente o complexo microambiente tumoral humano. A VMT se forma de novo dentro de uma plataforma microfluídica por co-cultivo de vários tipos de células humanas sob condições dinâmicas e fisiológicas de fluxo. Esta construção microtumoral projetada por tecido incorpora uma rede vascular viva perfundida que suporta a massa tumoral em crescimento, assim como os vasos recém-formados fazem in vivo. É importante ressaltar que drogas e células imunes devem atravessar a camada endotelial para alcançar o tumor, modelando barreiras fisiológicas in vivo para liberação terapêutica e eficácia. Uma vez que a plataforma VMT é opticamente transparente, imagens de alta resolução de processos dinâmicos, como extravasamento de células imunes e metástases, podem ser obtidas com a visualização direta de células marcadas fluorescentemente dentro do tecido. Além disso, o VMT retém a heterogeneidade tumoral in vivo , assinaturas de expressão gênica e respostas a drogas. Praticamente qualquer tipo de tumor pode ser adaptado à plataforma, e as células primárias de tecidos cirúrgicos frescos crescem e respondem ao tratamento medicamentoso no VMT, abrindo caminho para uma medicina verdadeiramente personalizada. Aqui, os métodos para estabelecer o VMT e utilizá-lo para a pesquisa em oncologia são descritos. Essa abordagem inovadora abre novas possibilidades para o estudo de tumores e respostas a drogas, fornecendo aos pesquisadores uma ferramenta poderosa para avançar na pesquisa sobre o câncer.

Introduction

O câncer continua sendo um grande problema de saúde em todo o mundo e é a segunda causa de morte nos Estados Unidos. Somente para o ano de 2023, o Centro Nacional de Estatísticas de Saúde prevê mais de 1,9 milhão de novos casos de câncer e mais de 600.000 mortes por câncer ocorrendo nos EUA¹, destacando a necessidade urgente de abordagens de tratamento eficazes. No entanto, atualmente, apenas 5,1% das terapêuticas anticâncer que entram em ensaios clínicos finalmente obtêm a aprovação da FDA. O fracasso de candidatos promissores em progredir com sucesso através de ensaios clínicos pode ser parcialmente atribuído ao uso de sistemas modelos não fi....

Protocol

1. Projeto e fabricação

1. Design do dispositivo
   1. Para a fabricação de dispositivos microfluídicos, criar um molde de SU-8 usando uma camada de 200 μm de SU-8 spin-revestida em um bolacha de Si-wafer (RCA-1 limpo e 2% fluoreto de hidrogênio (HF) tratado), seguido por uma etapa de fotolitografia de máscara única, conforme descrito anteriormente ^8,9.
   2. Fundir uma réplica de polidimetilsiloxano (PDMS) de 4 mm de espes.......

Discussion

Quase todos os tecidos do corpo recebem nutrientes e oxigênio através da vasculatura, tornando-se um componente crítico para a modelagem realista da doença e triagem de drogas in vitro. Além disso, várias neoplasias malignas e estados patológicos são definidos por disfunção e hiperpermeabilidade do endotélio^vascular3. Notavelmente, no câncer, a vasculatura associada ao tumor é frequentemente mal perfundida, interrompida e vazada, agindo assim como uma barreira para a entrega .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates	Greiner Bio-One	655096
Methanol ≥99.8% ACS	VWR Chemicals BDH	BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter,	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS membrane	PAX Industries	HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator	Bel-Art	F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate	VWR	82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow	4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope	Agilent	CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells	StemBioSys	N/A
Collagen I, rat tail	Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma	Neta Scientific	SIAL-341573
Fibronectin human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4)	Sigma-Aldrich	H6254
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells	Lonza	CC-2702
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1051
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (Electrophoresis),	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Gibco	12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Technology	LL-0003