Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול מוצג כדי להעריך אם EVs קטנים (sEVs) שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודל היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את מחסום הדם-מוח אצל עכברות בוגרות שאינן הרות.

Abstract

סיבוכים מוחיים, כולל בצקת מוחית ושבץ איסכמי ודימומי, מהווים את הגורם המוביל לתמותה אימהית הקשורה לרעלת הריון. המנגנונים הבסיסיים של סיבוכים מוחיים אלה עדיין אינם ברורים. עם זאת, הם קשורים לתפקוד לקוי של השליה ולהפרעה במחסום הדם-מוח (BBB). עם זאת, הקשר בין שני איברים מרוחקים אלה עדיין מתברר. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהשליה משחררת מולקולות איתות, כולל שלפוחיות חוץ-תאיות, למחזור הדם של האם. שלפוחיות חוץ-תאיות מסווגות לפי גודלן, כאשר שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV בקוטר קטן מ-200 ננומטר) נחשבות לחלקיקי איתות קריטיים הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתנאים פתולוגיים. ברעלת הריון, יש מספר מוגבר של sEV במחזור הדם האימהי, שפונקציית האיתות שלו אינה מובנת היטב. שליות שליה המשתחררות ברעלת הריון או שליות הריון רגילות החשופות להיפוקסיה גורמות לתפקוד לקוי של אנדותל המוח ולהפרעה ב- BBB. בפרוטוקול זה, אנו מעריכים אם sEVs שבודדו מצמחי שליה בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודלים של היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את BBB in vivo.

Introduction

כ-70% ממקרי המוות של אימהות עקב רעלת הריון, תסמונת הריון עם יתר לחץ דם המאופיינת בתהליכי שליה לקויים, תפקוד לקוי של האנדותל המערכתי של האם, ובמקרים חמורים כשל רב-מערכתי 1,2, קשורים לסיבוכים חריפים של כלי דם במוח 3,4. רוב מקרי המוות של אמהות מתרחשים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית5. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים עדיין אינם ברורים למרות הרלוונטיות הקלינית והאפידמיולוגית של סיבוכים מוחיים הקשורים לרעלת הריון.

מצד שני, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) (קוטר ~ 30-400 ננומטר) הן מתווכות חיוניות של תקשורת בין-תאית ב....

Protocol

המחקר בוצע בהתאם לעקרונות שבאו לידי ביטוי בהצהרת הלסינקי ובאישור ועדות הביקורת האתית המתאימות. כל המשתתפים האנושיים נתנו את הסכמתם מדעת לפני איסוף הדגימה, כפי שדווח קודם לכן25. בנוסף, ועדת הביואתיקה והבטיחות הביולוגית של אוניברסיטת Bío-Bío אישרה פרויקט זה (מענק Fondecyt 1200250). העבוד?.......

Representative Results

פרוטוקול זה מעריך את היכולת של sEVs שמקורם בשליות שגודלו בתרבית בהיפוקסיה לשבש את BBB בעכברות שאינן הרות. שיטה זו מאפשרת להבין טוב יותר את הקשר הפוטנציאלי בין השליה למוח בתנאים נורמליים ופתולוגיים. בפרט, שיטה זו עשויה להוות פרוקסי לניתוח השתתפות sEV שליה בהופעת סיבוכים מוחיים ברעלת הריון.

Discussion

מחקר זה חושף תובנות חדשות לגבי נזק פוטנציאלי הנובע מ-sEV שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים על שיבוש מחסום הדם-מוח של מכרסמים. המנגנון הפתולוגי כולל הפחתה ב- CLND-5 באזור המוח האחורי25.

מחקרים קודמים גילו כי פלסמה-sEV מאנשים עם רעלת הריון גורמים לתפקוד ל?.......

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לחוקרים השייכים ל-GRIVAS Health על תרומתם רבת הערך. כמו כן, מיילדות וצוות קליני משירות המיילדות והגינקולוגיה שייכים לבית החולים דה צ'ילאן, צ'ילה. נוסדה על ידי Fondecyt Regular 1200250.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adult mice brain slecer matrice 3D printedOpen access fileAdult miceAdult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibodySigma-AldrichClon AC-74Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibodySanta cruz Biotechnologysc-374221Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kitThermo Scientific23225Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mLThermo Fisher Scientificm200500Culture media for placental explants
D180 CO2 incubatorRWD Life scienceD180Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 gSigma-AldrichE2129.10GDye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mLThermo Fisher Scientific16000044Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NXHimac eppendorf group5720410101Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ softwareNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mLUSP Baxter212-094Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive Promega0000105232In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibodyThermo Fisher ScientificMO 63103Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300Malvern Panalytical90278090Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mLThermo Fisher ScientificA11313.22Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mLThermo Fisher Scientific10010023Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mLThermo Fisher Scientific10378016Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber ControllerBioSpherixSCR_021131CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 gChemie7061humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia systemKent ScientificsSS-01Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platformKent ScientificsA41166Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mmSouthern labware10026Filtration of condicioned media harvested from placental explants 
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15REHitachi medical systems6020Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x Center Medical2597Stereomicroscope to register brain slices

References

  1. Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
  2. Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia.....

Explore More Articles

JoVE203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved