הפרעה במחסום הדם-מוח של העכבר על ידי בועיות חוץ-תאיות קטנות משליה אנושית היפוקסית

Summary

פרוטוקול מוצג כדי להעריך אם EVs קטנים (sEVs) שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודל היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את מחסום הדם-מוח אצל עכברות בוגרות שאינן הרות.

Abstract

סיבוכים מוחיים, כולל בצקת מוחית ושבץ איסכמי ודימומי, מהווים את הגורם המוביל לתמותה אימהית הקשורה לרעלת הריון. המנגנונים הבסיסיים של סיבוכים מוחיים אלה עדיין אינם ברורים. עם זאת, הם קשורים לתפקוד לקוי של השליה ולהפרעה במחסום הדם-מוח (BBB). עם זאת, הקשר בין שני איברים מרוחקים אלה עדיין מתברר. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהשליה משחררת מולקולות איתות, כולל שלפוחיות חוץ-תאיות, למחזור הדם של האם. שלפוחיות חוץ-תאיות מסווגות לפי גודלן, כאשר שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV בקוטר קטן מ-200 ננומטר) נחשבות לחלקיקי איתות קריטיים הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתנאים פתולוגיים. ברעלת הריון, יש מספר מוגבר של sEV במחזור הדם האימהי, שפונקציית האיתות שלו אינה מובנת היטב. שליות שליה המשתחררות ברעלת הריון או שליות הריון רגילות החשופות להיפוקסיה גורמות לתפקוד לקוי של אנדותל המוח ולהפרעה ב- BBB. בפרוטוקול זה, אנו מעריכים אם sEVs שבודדו מצמחי שליה בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודלים של היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את BBB in vivo.

Introduction

כ-70% ממקרי המוות של אימהות עקב רעלת הריון, תסמונת הריון עם יתר לחץ דם המאופיינת בתהליכי שליה לקויים, תפקוד לקוי של האנדותל המערכתי של האם, ובמקרים חמורים כשל רב-מערכתי ^1,2, קשורים לסיבוכים חריפים של כלי דם במוח ^3,4. רוב מקרי המוות של אמהות מתרחשים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית⁵. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים עדיין אינם ברורים למרות הרלוונטיות הקלינית והאפידמיולוגית של סיבוכים מוחיים הקשורים לרעלת הריון.

מצד שני, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) (קוטר ~ 30-400 ננומטר) הן מתווכות חיוניות של תקשורת בין-תאית ב....

Protocol

המחקר בוצע בהתאם לעקרונות שבאו לידי ביטוי בהצהרת הלסינקי ובאישור ועדות הביקורת האתית המתאימות. כל המשתתפים האנושיים נתנו את הסכמתם מדעת לפני איסוף הדגימה, כפי שדווח קודם לכן²⁵. בנוסף, ועדת הביואתיקה והבטיחות הביולוגית של אוניברסיטת Bío-Bío אישרה פרויקט זה (מענק Fondecyt 1200250). העבוד?.......

Discussion

מחקר זה חושף תובנות חדשות לגבי נזק פוטנציאלי הנובע מ-sEV שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים על שיבוש מחסום הדם-מוח של מכרסמים. המנגנון הפתולוגי כולל הפחתה ב- CLND-5 באזור המוח האחורי²⁵.

מחקרים קודמים גילו כי פלסמה-sEV מאנשים עם רעלת הריון גורמים לתפקוד ל?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult mice brain slecer matrice 3D printed	Open access file	Adult mice	Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody	Sigma-Aldrich	Clon AC-74	Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody	Santa cruz Biotechnology	sc-374221	Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit	Thermo Scientific	23225	Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL	Thermo Fisher Scientific	m200500	Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator	RWD Life science	D180	Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g	Sigma-Aldrich	E2129.10G	Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL	Thermo Fisher Scientific	16000044	Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX	Himac eppendorf group	5720410101	Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL	USP Baxter	212-094	Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive	Promega	0000105232	In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	MO 63103	Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	90278090	Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A11313.22	Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010023	Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL	Thermo Fisher Scientific	10378016	Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller	BioSpherix	SCR_021131	CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g	Chemie	7061	humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system	Kent Scientifics	SS-01	Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform	Kent Scientifics	A41166	Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm	Southern labware	10026	Filtration of condicioned media harvested from placental explants
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE	Hitachi medical systems	6020	Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x	Center Medical	2597	Stereomicroscope to register brain slices