A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
פרוטוקול מוצג כדי להעריך אם EVs קטנים (sEVs) שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודל היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את מחסום הדם-מוח אצל עכברות בוגרות שאינן הרות.
סיבוכים מוחיים, כולל בצקת מוחית ושבץ איסכמי ודימומי, מהווים את הגורם המוביל לתמותה אימהית הקשורה לרעלת הריון. המנגנונים הבסיסיים של סיבוכים מוחיים אלה עדיין אינם ברורים. עם זאת, הם קשורים לתפקוד לקוי של השליה ולהפרעה במחסום הדם-מוח (BBB). עם זאת, הקשר בין שני איברים מרוחקים אלה עדיין מתברר. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהשליה משחררת מולקולות איתות, כולל שלפוחיות חוץ-תאיות, למחזור הדם של האם. שלפוחיות חוץ-תאיות מסווגות לפי גודלן, כאשר שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV בקוטר קטן מ-200 ננומטר) נחשבות לחלקיקי איתות קריטיים הן בתנאים פיזיולוגיים והן בתנאים פתולוגיים. ברעלת הריון, יש מספר מוגבר של sEV במחזור הדם האימהי, שפונקציית האיתות שלו אינה מובנת היטב. שליות שליה המשתחררות ברעלת הריון או שליות הריון רגילות החשופות להיפוקסיה גורמות לתפקוד לקוי של אנדותל המוח ולהפרעה ב- BBB. בפרוטוקול זה, אנו מעריכים אם sEVs שבודדו מצמחי שליה בתרבית בתנאים היפוקסיים (מודלים של היבט אחד של רעלת הריון) משבשים את BBB in vivo.
כ-70% ממקרי המוות של אימהות עקב רעלת הריון, תסמונת הריון עם יתר לחץ דם המאופיינת בתהליכי שליה לקויים, תפקוד לקוי של האנדותל המערכתי של האם, ובמקרים חמורים כשל רב-מערכתי 1,2, קשורים לסיבוכים חריפים של כלי דם במוח 3,4. רוב מקרי המוות של אמהות מתרחשים במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית5. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים עדיין אינם ברורים למרות הרלוונטיות הקלינית והאפידמיולוגית של סיבוכים מוחיים הקשורים לרעלת הריון.
מצד שני, שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) (קוטר ~ 30-400 ננומטר) הן מתווכות חיוניות של תקשורת בין-תאית ב....
המחקר בוצע בהתאם לעקרונות שבאו לידי ביטוי בהצהרת הלסינקי ובאישור ועדות הביקורת האתית המתאימות. כל המשתתפים האנושיים נתנו את הסכמתם מדעת לפני איסוף הדגימה, כפי שדווח קודם לכן25. בנוסף, ועדת הביואתיקה והבטיחות הביולוגית של אוניברסיטת Bío-Bío אישרה פרויקט זה (מענק Fondecyt 1200250). העבוד?.......
פרוטוקול זה מעריך את היכולת של sEVs שמקורם בשליות שגודלו בתרבית בהיפוקסיה לשבש את BBB בעכברות שאינן הרות. שיטה זו מאפשרת להבין טוב יותר את הקשר הפוטנציאלי בין השליה למוח בתנאים נורמליים ופתולוגיים. בפרט, שיטה זו עשויה להוות פרוקסי לניתוח השתתפות sEV שליה בהופעת סיבוכים מוחיים ברעלת הריון.
מחקר זה חושף תובנות חדשות לגבי נזק פוטנציאלי הנובע מ-sEV שבודדו מצמחי שליה שגודלו בתרבית בתנאים היפוקסיים על שיבוש מחסום הדם-מוח של מכרסמים. המנגנון הפתולוגי כולל הפחתה ב- CLND-5 באזור המוח האחורי25.
מחקרים קודמים גילו כי פלסמה-sEV מאנשים עם רעלת הריון גורמים לתפקוד ל?.......
למחברים אין שום ניגוד עניינים להצהיר.
המחברים רוצים להודות לחוקרים השייכים ל-GRIVAS Health על תרומתם רבת הערך. כמו כן, מיילדות וצוות קליני משירות המיילדות והגינקולוגיה שייכים לבית החולים דה צ'ילאן, צ'ילה. נוסדה על ידי Fondecyt Regular 1200250.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adult mice brain slecer matrice 3D printed | Open access file | Adult mice | Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament. |
Anti β-Actin primary antibody | Sigma-Aldrich | Clon AC-74 | Antibody for loading control (Western blot) |
Anti-Claudin5 primary antibody | Santa cruz Biotechnology | sc-374221 | Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot) |
BCA protein kit | Thermo Scientific | 23225 | Kit for measuring protein concentration |
Culture media #200 500 mL | Thermo Fisher Scientific | m200500 | Culture media for placental explants |
D180 CO2 incubator | RWD Life science | D180 | Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor |
Evans blue dye > 75% 10 g | Sigma-Aldrich | E2129.10G | Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO |
Fetal bovine serum 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | Additive growth factor for culture media 200 |
Himac Ultracentrifuge CP100NX | Himac eppendorf group | 5720410101 | Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g |
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Isoflurane x 100 mL | USP Baxter | 212-094 | Volatile inhalated anaesthesia agent for mice |
Kit CellTiter 96 Non-radioactive | Promega | 0000105232 | In vitro assay for placental explants viability |
Mouse IgG Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | MO 63103 | Secondary antibody for CLDN5 (western blot) |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | 90278090 | Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media |
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL | Thermo Fisher Scientific | A11313.22 | Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted) |
PBS 1 X pH 7.4 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Wash solution for placenta explants |
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | Antiobiotics for placental explants culture media |
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller | BioSpherix | SCR_021131 | CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp |
Sodium Thiopental 1 g | Chemie | 7061 | humanitarian euthanasia agent |
Somnosuite low flow anesthesia system | Kent Scientifics | SS-01 | Isoflurane vaporizer for small rodents |
Surgical Warming platform | Kent Scientifics | A41166 | Warming platform for mainteinance anesthesia in mice |
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm | Southern labware | 10026 | Filtration of condicioned media harvested from placental explants |
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE | Hitachi medical systems | 6020 | Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g |
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x | Center Medical | 2597 | Stereomicroscope to register brain slices |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved