Ruptura da Barreira Hematoencefálica de Camundongos por Pequenas Vesículas Extracelulares de Placentas Humanas Hipóxicas

Summary

Um protocolo é apresentado para avaliar se pequenos EVs (sEVs) isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas (modelando um aspecto da pré-eclâmpsia) rompem a barreira hematoencefálica em camundongos fêmeas adultas não grávidas.

Abstract

As complicações cerebrovasculares, incluindo edema cerebral e acidente vascular cerebral isquêmico e hemorrágico, constituem a principal causa de mortalidade materna associada à pré-eclâmpsia. Os mecanismos subjacentes dessas complicações cerebrovasculares permanecem obscuros. No entanto, eles estão ligados à disfunção placentária e à interrupção da barreira hematoencefálica (BHE). No entanto, a conexão entre esses dois órgãos distantes ainda está sendo determinada. Evidências crescentes sugerem que a placenta libera moléculas sinalizadoras, incluindo vesículas extracelulares, na circulação materna. As vesículas extracelulares são categorizadas de acordo com seu tamanho, sendo que pequenas vesículas extracelulares (sEVs menores que 200 nm de diâmetro) são consideradas partículas sinalizadoras críticas em condições fisiológicas e patológicas. Na pré-eclâmpsia, há um aumento do número de EVs circulantes na circulação materna, cuja função de sinalização não é bem compreendida. Os EVs placentários liberados na pré-eclâmpsia ou em placentas gestacionais normais expostas à hipóxia induzem disfunção endotelial cerebral e interrupção da BHE. Neste protocolo, avaliamos se sEVs isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas (modelando um aspecto da pré-eclâmpsia) interrompem a BHE in vivo.

Introduction

Aproximadamente 70% das mortes maternas por pré-eclâmpsia, síndrome hipertensiva da gravidez caracterizada por processos de placentação prejudicados, disfunção endotelial sistêmica materna e, em casos graves, falência de múltiplos órgãos ^1,2, estão associadas a complicações cerebrovasculares agudas ^3,4. A maioria das mortes maternas ocorre em países de baixa e média^renda5. No entanto, os mecanismos subjacentes ainda não estão claros, apesar da relevância clínica e epidemiológica das complicações cerebrovasculares associadas à pr....

Protocol

A pesquisa foi realizada seguindo os princípios expressos na Declaração de Helsinque e sob autorização dos respectivos Comitês de Ética em Pesquisa. Todos os participantes humanos deram seu consentimento informado antes da coleta da amostra, conforme relatado anteriormente²⁵. Adicionalmente, o Comitê de Bioética e Biossegurança da Universidade Bío-Bío aprovou este projeto (bolsa Fondecyt 1200250). O trabalho com animais foi conduzido de acordo com os princípios cardeais dos três R's .......

Discussion

Este estudo revela novos insights sobre danos potenciais resultantes de sEVs isolados de explantes placentários cultivados em condições hipóxicas sobre o rompimento da barreira hematoencefálica de roedores. O mecanismo patológico envolve a redução do CLND-5 na região posterior do cérebro²⁵.

Investigações prévias revelaram que os sEVs plasmáticos de indivíduos com pré-eclâmpsia induzem disfunção endotelial em vários órgãos usando modelos in vitr.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adult mice brain slecer matrice 3D printed	Open access file	Adult mice	Adult mice brain slicer. Printed in PLA filament.
Anti β-Actin primary antibody	Sigma-Aldrich	Clon AC-74	Antibody for loading control (Western blot)
Anti-Claudin5 primary antibody	Santa cruz Biotechnology	sc-374221	Primary antibody for tight junction protein CLDN5 of mice BBB (Western blot)
BCA protein kit	Thermo Scientific	23225	Kit for measuring protein concentration
Culture media #200 500 mL	Thermo Fisher Scientific	m200500	Culture media for placental explants
D180 CO2 incubator	RWD Life science	D180	Standard incubator to estabilize explants and culture sEVs-Nor
Evans blue dye  > 75% 10 g	Sigma-Aldrich	E2129.10G	Dye to analize blood brain barrier disruption IN VIVO
Fetal bovine serum 500 mL	Thermo Fisher Scientific	16000044	Additive growth factor for culture media 200
Himac Ultracentrifuge CP100NX	Himac eppendorf group	5720410101	Ultracentrifuge for condicioned media > 1,20,000 x g
ImageJ software	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mL	USP Baxter	212-094	Volatile inhalated anaesthesia agent for mice
Kit CellTiter 96 Non-radioactive	Promega	0000105232	In vitro assay for placental explants viability
Mouse IgG Secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	MO 63103	Secondary antibody for CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	90278090	Nanotracking analysis of particles from placental explants condicioned media
Paraformaldehide E 97% solution 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A11313.22	Fixative solution for brain tissue slices and intracardial perfusion (once diluted)
PBS 1 X pH 7.4 500 mL	Thermo Fisher Scientific	10010023	Wash solution for placenta explants
Peniciline-streptomicine 100x 20 mL	Thermo Fisher Scientific	10378016	Antiobiotics for placental explants culture media
ProOX C21 Cytocentric O2 and CO2 Subchamber Controller	BioSpherix	SCR_021131	CO2 regulator to induce Hypoxia in sealed chamber for sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 g	Chemie	7061	humanitarian euthanasia agent
Somnosuite low flow anesthesia system	Kent Scientifics	SS-01	Isoflurane vaporizer for small rodents
Surgical Warming platform	Kent Scientifics	A41166	Warming platform for mainteinance anesthesia in mice
Syringe Filters, Polytetrafluoroethylene (PTFE), Hydrophobic, 0.22 µm, Sterile, 25 mm	Southern labware	10026	Filtration of condicioned media harvested from placental explants
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges HITACHI himac CT15E/CT15RE	Hitachi medical systems	6020	Serial centrifugations of condicioned media < 1,20, 000 x g
Trinocular stereomicroscope transmided and reflective light 10x-160x	Center Medical	2597	Stereomicroscope to register brain slices