הפעלה עצבית מרחוק יחד עם דגימת דם אוטומטית כדי לגרום ולמדוד הורמון luteinizing במחזור בעכברים

Summary

פעימות הורמון luteinizing (LH) הוא סימן היכר של תפקוד הרבייה. אנו מתארים פרוטוקול להפעלה מרחוק של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות הקשורות לאיסוף דם אוטומטי סדרתי. טכניקה זו מאפשרת אפנון הורמונלי מתוזמן, ריבוב ומזעור השפעות מניפולציה על רמות LH בבעלי חיים הנעים בחופשיות מודעת, וללא הפרעה.

Abstract

רמות הורמון luteinizing במחזור הדם (LH) הן מדד חיוני לתפקוד הבקרה ההיפותלמוסית-יותרת המוח של רבייה. תפקידם של קלטים רבים ואוכלוסיות עצביות באפנון שחרור LH עדיין אינו ידוע. מדידת שינויים ברמות LH בעכברים היא לעתים קרובות אתגר מכיוון שהם מופרעים בקלות על ידי לחץ סביבתי. הטכניקות הנוכחיות למדידת שחרור LH ופעימה דורשות הכשרה ארוכת טווח לעכברים להסתגל ללחץ מניפולציה, ריסון מסוים, נוכחות החוקר, ועבודה על בעלי חיים בודדים, מה שמקטין את התועלת שלה לשאלות מחקר רבות.

מאמר זה מציג טכניקה להפעלה מרחוק של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות באמצעות טכנולוגיית Designer Receptor Exclusivd by Designer Drugs (DREADDs) בשילוב עם דגימת דם אוטומטית רציפה בעכברים מודעים, נעים בחופשיות וללא הפרעות. ראשית אנו מתארים את פרוטוקול הניתוח הסטריאוטקסי כדי לספק וקטורים הקשורים לווירוס אדנו (AAV) המבטאים DREADDs לאוכלוסיות נוירונים ספציפיות. לאחר מכן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור קנולציה של עורק התרדמה ווריד הצוואר וחיבור לאחר ניתוח למערכת דגימת הדם האוטומטית CULEX. לבסוף, אנו מתארים את הפרוטוקול להזרקה תוך ורידית של clozapine-N-oxide להפעלה עצבית מרחוק ואיסוף דם אוטומטי. טכניקה זו מאפשרת דגימה אוטומטית מתוכנתת כל 5 דקות או יותר לתקופה נתונה, יחד עם הזרקת חומר תוך ורידי בנקודת זמן או משך זמן רצויים. בסך הכל, מצאנו שטכניקה זו היא גישה רבת עוצמה למחקר על בקרה נוירואנדוקרינית.

Introduction

ציר ההיפותלמו-יותרת המוח-גונדל (HPG) מווסת באופן מרכזי על ידי שחרור פולסטילי של הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH) למערכת פורטל יותרת המוח. בבלוטת יותרת המוח, GnRH שולט בשחרור פולסטילי של גונדוטרופינים, הורמון luteinizing (LH), והורמון מגרה זקיק (FSH) למערכת הדם. שחרור פולסטיל LH משמש כסימן היכר לתפקוד ציר HPG מרכזי 1,2,3,4. לדוגמה, הוא מציג את ההשפעות של שינויים גנטיים או שינויים בגורמים הורמונליים או סביבתיים על החלק העצבי של ציר ^5,6,7. עד לאחרונה, מדידת תבנית פולסטילית LH הייתה מוגבלת ליונקים גדולים⁸ וחולדות⁹, בהתחשב בתדירות הגבוהה של הדגימה ובנפחי הדם הגדולים הדרושים לזיהוי הפולסים.

זיהוי פולסי LH בעכברים הוא רצוי מכיוון שלמין זה יש מודלים גנטיים רחבים זמינים וניתן לתמרן אותו בקלות באמצעות טכנולוגיות הנדסה גנומית כדי להמשיך לחקור גנים ספציפיים ואוכלוסיות תאים. בעשור האחרון, התקדמות גדולה בניתוח ריכוזי LH בעכברים באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים LH סנדוויץ' (ELISA) אפשרה לזהות LH בכמות זעירה של דם¹⁰. פיתוח טכניקת דגימת הדם התכופה בקצה הזנב איפשר את הדגימה התכופה הדרושה לאיתור התדירות והמשרעת של פולסי LH בעכברים^10,11. עם זאת, דגימת דם בקצה הזנב מוגבלת לשימוש בו בבעלי חיים ערים בהכרה; זה דורש תקופת הכשרה ארוכה לעכברים להסתגל לטיפול ולנוכחות של חוקר ייעודי במהלך הדגימה. הצלחתו רגישה מאוד לגורמי עקה סביבתיים וייתכן שאינה מתאימה לשימוש בזני עכברים המראים רמות גבוהות של חרדה. קנולציה תוך-פרוזדורית שימשה גם לדגימת דם תכופה בעכברים מודעים הנעים בחופשיות¹². עם זאת, הגדרה זו עדיין דורשת דגימת דם ידנית חוזרת ומגבילה את מרחב התנועה של בעלי החיים, בעוד קנולציה פרוזדורית יכולה להוביל לשינויים דינמיים בתפקוד הלב. לכן רצוי לבסס שיטה לאיסוף דם בתנאים נטולי לחץ בעכברים מודעים, נעים בחופשיות וללא הפרעות ללא צורך באימון מוקדם או בטיפול או נוכחות אנושית.

דגימת דם או דיאליזה אוטומטית שימשה בעבר למדידת רמות הורמונים שונות (למשל, מלטונין^13,14) והפרשת הפעימות שלהם (למשל, הורמון גדילה)¹⁵ במכרסמים לא מרוסנים. אנו מציגים כאן פרוטוקול לדגימת דם אוטומטית תכופה לטווח ארוך בבעלי חיים מודעים ובלתי מרוסנים, יחד עם הפעלה מרחוק בזמן של אוכלוסיות נוירונים ספציפיות באמצעות טכנולוגיות כימוגנטיות: קולטני המעצבים המופעלים באופן בלעדי על ידי סמי פיצוציות (DREADDs). נתאר את ההעברה הסטריאוטקסית של וקטור וירוס הקשור לאדנו (AAV) ואת ההפעלה מרחוק על ידי מסירה אוטומטית תוך ורידית (IV) של קלוזאפין-N-אוקסיד (CNO)^16,17. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי רציף של רמות הבסיס ושינויים מושרים בפעימות LH במספר בעלי חיים בו זמנית. הן דגימת הדם והן מתן העירוי של התרכובת מתבצעות באופן מבוקר בזמן באמצעות תוכנת מחשב המבטלת את נוכחותו הפיזית של החוקר או את הדרישה לאימון עכבר קודם. שיטה זו מתגברת על המגבלות העיקריות של דגימת דם ידנית. הוא מאפשר דגימת דם במצב נטול מתח, ואספקת תרכובת עירוי בו זמנית יחד עם בקרת פעילות עצבית מרחוק. אנו מציגים תוצאות מייצגות של השימוש בדגימת דם אוטומטית לבד או בשילוב עם הפעלה עצבית מרחוק ודנים ביתרונותיה, מגבלותיה ושימושים נוספים.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים מבוצעים בהתאם למדריך המועצה הלאומית למחקר לטיפול ושימוש בחיות מעבדה¹⁸ וכן לחוקים פדרליים, מדינתיים ומקומיים. נקבות עכברים בוגרות (בנות 3-6 חודשים) שימשו להדגמת פרוטוקול זה, כולל ארבע נקבות C57BL/6J וארבע Kiss1-Cre; נקבות ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP). עכברים הוחזקו תחת מחזור אור:חושך 12:12, טמפרטורה מבוקרת ב 22 מעלות צלזיוס, והוזנו אד ליביטיום על דיאטה נמוכה phytoestrogen. נהלים ופרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן (IACUC, Animal Protocols: PRO00010420 and PRO00010138).

1. העברה סטריאוטקסית של AAVs לאוכלוסיית תאים ספציפית

1. הכנה לניתוח
   1. לעקר את כל הכלים. הכינו חבילות מרובות של כלים כירורגיים כדי להבטיח שכל חבילה תשמש לא יותר מחמישה בעלי חיים. הכינו כפפות סטריליות, מינימום זוג אחד לכל חיה.
   2. משוך מיקרופיפטות זכוכית להזרקה באמצעות ההגדרות הבאות (ראה טבלת חומרים) עבור מיקרופיפטות דקות וארוכות המזריקות לאט ובהתמדה ואינן נסתמות בקלות: חום 1: 915, חום 2: 630, משיכה: 630. מטב הגדרות אלה עבור כל מושך.
   3. ביצוע ניתוחים בחלל כירורגי ייעודי. יש לחטא משטחי ניתוח באתנול 70%.
   4. השתמש וילונות סטריליים כדי לשמור על סטריליות של שדה הניתוח. יש ללבוש מעיל מעבדה נקי או חלוק חד פעמי ומסכה.
   5. הכינו מערכת הרדמה בשאיפה. פתח את אספקת החמצן ומווסת את קצב הזרימה ל-0.8 ליטר/דקה.
2. כירורגיה
   1. הניחו את העכבר בקופסת הרדמה ופתחו את האיזופלורן ל-2.5%. להפחית את זרימת isoflurane ל 2% לאחר השראה ראשונית; לשמור על זרימה לאורך כל ההליך. לשיטות הרדמה חלופיות, עיין בפרוטוקול בעלי חיים ובהנחיות ועדת האתיקה המקומית.
   2. יש להזריק משכך כאבים מונע (קרפרופן 5 מ"ג/ק"ג s.c.) בעקבות המלצת הוועדה לשימוש בבעלי חיים והתקנות המקומיות.
   3. גלח את ראש העכבר באמצעות קוצצים.
   4. התקינו את בעל החיים על שולחן סטריאוטקסי, הניחו מוטות אוזניים וודאו שהראש קבוע ויציב כראוי. מקבעים את פיו של העכבר לפיה, ומקפידים למקם את הלשון בצד החיצוני של הפה כדי למנוע חנק.
   5. ודא כי בעל החיים מורדם עמוקות עם צביטת בוהן לפני תחילת הניתוח ועקוב אחר נשימתו וצבעו של העכבר לאורך כל ההליך.
   6. מקם תמיכת הגבהה מתחת לעכבר כדי לשמור על הגוף והראש מפולסים במצב אופקי. שמור על החיה חמה עם כרית חמה מכוסה נייר. יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים כדי למנוע ייבוש.
   7. שמור על אזור הניתוח נקי ככל האפשר. יש ללבוש כפפות סטריליות. יש לחטא את ראש העכבר ביוד ואלכוהול לפני פתיחת העור. בעזרת אזמל, חותכים את העור בראש לאורך קו האמצע, בערך מאחורי העיניים עד מאחורי תפר הלמדא. שמרו על הגולגולת חשופה ונקו אותה בעזרת צמר גפן משובץ ב-0.9% NaCl סטרילי.
   8. מצאו את וריד הרמינל הרוסטרלי (RRV) וסמנו אותו בעיפרון סטרילי. השתמש בסטריאוסקופ עבור שאר ההליך.
      הערה: אנו משיגים תוצאות טובות יותר באמצעות RRV כהפניה קדמית, אך מקובל להשתמש בברגמה כהפניה.
   9. באמצעות מחט סטרילית כהפניה, ודא כי כיוון המוח נכון לפני שתמשיך למדידות סטריאוטקסיות. ודא גם כי הגבהים של פני הגולגולת ב RRV ו lambda, כמו גם את הנטייה לרוחב, זהים (± 0.02 מ"מ).
      הערה: הנטייה הצידית הופכת רלוונטית יותר להזרקה למבני מוח רוחביים יותר.
   10. לטעון פיפטה זכוכית סטרילית עם פתרון ויראלי להיות מוזרק. הבא אותו להפניה RRV עבור הפניה 0 anteroposterior (AP). התקדמו לאורך תפר הקשת לקואורדינטת AP לפי בחירתכם. סמן עמדה זו עם עיפרון סטרילי, להרים את המחט, ולהמשיך craniotomy.
   11. בזהירות לקדוח עיגול קטן סביב המיקום המסומן כדי למנוע שבירת הסינוס העליון sagittal. מקם את המקדחה במצב מוטה ולא מאונך כדי להפחית את הלחץ בזמן הקידוח. הסר את חתיכת הגולגולת עם מלקחיים קטנים.
   12. לאחר חשיפת כלי הדם, השתמש באמצע הסינוס הסגיטלי העליון כדי להשתמש בו כהפניה מדיולטרלית (ML) (נקודה 0); זה מדויק יותר מאשר להשתמש בתפר הסגיטלי. עבור לעמדת ML הנבחרת. מנמיכים את פיפטה כדי לגעת בדורה-מאטר כנקודת הייחוס הגבית (DV) (נקודה 0). מעט לשבור את dura-mater ולרדת פיפטה למצב DV של בחירה.
   13. הזריקו את הכמות הרצויה של AAV (50-200 nL) והשאירו את הצינורית במקומה למשך 3 דקות כדי לאפשר פיזור נוזלים הולם. הסר את פיפטה בזהירות החוצה מהמוח.
   14. שחררו את העכבר מהאוזניות. סגור את העור באמצעות קליפסים כירורגיים או כל שיטה לבחירה. שים את החיה בכלוב מחומם נפרד להתאוששות. עקוב אחר התאוששות, תגובתיות ופעילות לאחר שהעכבר ער. לאחר החלמתו המלאה, החזירו את העכבר לכלוב המקורי שלו.
3. המתן מינימום של 3-4 שבועות לביטוי ויראלי לפני שתמשיך בחלק השני של ההליך.

2. וריד הצוואר ועורק התרדמה

1. הכנה לניתוח
   1. ביצוע ניתוחים בחלל כירורגי ייעודי. יש לחטא משטחי ניתוח עם אתנול 70% לפני תחילת ההליכים. הכינו חבילות מרובות של כלים כירורגיים כדי להבטיח שכל חבילה תשמש לא יותר מחמישה בעלי חיים.
   2. Autoclave כל כלי הניתוח. לאחר מכן, נקו במים סטריליים או מלוחים וחיטאו את הכלים במעקר חרוזים חם למשך 15 שניות לפחות (על פי הוראות היצרן) בין ניתוחים.
   3. השתמש וילונות סטריליים כדי לשמור על סטריליות של שדה הניתוח. יש ללבוש מעיל מעבדה נקי או חלוק חד פעמי ומסכה.
   4. הכינו מיקרו-צנתרים לקנולציות בעורק התרדמה ובווריד הצוואר. בנה את צנתר העורק על ידי חיבור קטע קטן של צינורות microrenathane (מתוח מ 0.025 אינץ 'קוטר חיצוני [OD] x 0.012 אינץ 'קוטר פנימי [ID]) עם צינורות סילסטיים (0.025 אינץ 'OD x 0.012 אינץ 'ID). בנה את הצנתר הוורידי רק באמצעות צינורות סילסטיים (0.025 אינץ 'OD x 0.012 אינץ 'ID). יש להשרות את כל הצנתרים באתנול 70% למשך הלילה לפני הניתוח.
   5. שיפוע הקצוות החתוכים של שני הצנתרים ב-45° באורכים משוערים מראש בהתבסס על משקל הגוף והאורך של החיה.
2. הליכים כירורגיים
   1. יש להרדים את בעלי החיים מתחת ל-2% איזופלורן באמצעות מערכת איזופלורן שולחנית בזרימה נמוכה כדי לשלוט במדויק בשלב ההרדמה ובמישור במהלך הניתוח.
   2. יש להזריק את המינון המקדים של משכך כאבים (קרפרופן 5 מ"ג/ק"ג s.c.) ולמרוח משחה אופתלמית למניעת התייבשות ופציעות בקרנית.
   3. לגלח את אזורי הגחון והגב של הצוואר ולנקות את העור עם שלושה פילינג יוד לסירוגין עם 70% אתנול. חתכו חתך עור אנכי (12 מ"מ) בין השכמות וכסו אותו בגזה כירורגית לשימוש מאוחר יותר. הניחו את בעל החיים במצב שכיבה עם הראש לכיוון המנתח.
   4. השתמש בטווח ניתוח סטריאו עבור רוב החלקים של ההליכים המתוארים להלן.
   5. בצע חתך אנכי קטן (~ 10 מ"מ) בצד ימין של הצוואר, עדיף על עצם הבריח כדי לחשוף את עורק התרדמה הימני ווריד הצוואר. חתכו את העור במספריים ובצעו דיסקציה קהה להפרדת רקמות תת עוריות באמצעות מלקחיים מיקרו ללא שיניים עם קצוות עדינים, תוך חשיפת וריד הצוואר החיצוני הימני ועורק התרדמה המשותף הנכון.
   6. קשרו את הקצה הדיסטלי של הווריד הצווארי כדי לעצור את זרימת הדם וחתכו חור קטן בווריד שהתמוטט באמצעות מיקרו מלקחיים ומספריים. הכנס את הצנתר הוורידי בשיפוע כלפי מטה ובעזרת זוג מיקרו מלקחיים כדי לקדם אותו דרך הווריד הנבוב העליון כדי להגיע לגובה האטריום הימני. האורך המוכנס הוא ~ 10-12 מ"מ עבור עכבר רזה 30 גרם. קשרו את הצנתר לקיבוע עם כלי הדם באמצעות 7-0 תפרי משי.
      הערה: עם קטטר במקום הנכון, דם ניתן למשוך בקלות; אחרת, הצנתר עלול להיות לא במקום לתוך וריד החזה לרוחב ויש צורך להחדיר אותו מחדש.
   7. נתחו בזהירות את רקמות החיבור כדי לחשוף את עורק התרדמה המשותף הימני הממוקם באזור משולש המוקף בשריר הסטרומיואיד, שריר הסטרנומסטואיד ושריר הקיבה. השתמש במחזיר חוטים כדי להפריד שרירים אלה במידת הצורך. קשרו את העורק ברמת הביפורקציה של עורקי התרדמה הפנימיים והחיצוניים באמצעות 7-0 תפרי משי. הנח שתי לולאות תפר לא קשורות בסמיכות.
   8. עצור זמנית את זרימת הדם על ידי משיכת לולאת תפר מוחלפת וחתך או ניקב חור קטן בדופן כלי הדם באמצעות מספריים זעירים או מחט 27 גרם. יש להכניס את הצנתר העורקי בשיפוע כלפי מטה ובסמיכות לאורך משוער מראש המגיע לקשת אבי העורקים אך מבלי לגעת במסתם אבי העורקים. האורך המוכנס הוא ~ 9-10 מ"מ עבור עכבר רזה של 30 גרם. קשרו את הצנתר לקיבוע בכלי הדם באמצעות שני התפרים המוחלפים.
   9. מנהרו את כל הצנתרים באופן תת-עורי וחיסלו אותם בחלק האחורי של הצוואר דרך החתך החתוך מראש וחברו אותם ליציאות הוורידיות או העורקיות של מחבר צינורות מצופה סיליקון העשוי מצינורות מחט 25 G: שונה MASA¹⁹ באמצעות שני צינורות מחט 25 G ושני צינורות PE-20 בגודל 4.0 ס"מ, עם שרוולים עם 2.0 ס"מ של צינורות סילסטיים ID בגודל 0.062 אינץ 'המחוברים עם טבעת מתכת קטנה עשויה חוט. נפח הלומן הכולל של כל צנתר, כולל המחבר, הוא 6-8 μL (איור 1A).
   10. סגור את החתך הגחוני וקבע את המחבר תת עורית עם סגירת העור האחורי עם תפרים. מלאו את שני הצנתרים במי מלח הפריניזציה (200 U/mL) וחברו אותם בחוזקה בסוף עם חוטי ניתוח מנירוסטה.
   11. עכברים מתאוששים מהרדמה איזופלורנית תוך דקות ומתאוששים לחלוטין מהניתוח תוך 5 ימים. הניחו את בעלי החיים בתא איסוף הדם האוטומטי 24 שעות לאחר הניתוח וחברו אותם למערכת על ידי חיבור וו הקשירה של המערכת לטבעת המתכת המחוברת למחבר הצינור המושתל בעורף. חברו את הצנתרים העורקיים והוורידיים לקו ההזרקה והדגימה, בהתאמה, 24 שעות לפני תחילת הדגימה (איור 1B). אורכו הכולל של קו הדגימה הוא 55 ס"מ אורך או 40 מיקרוליטר בנפח לומן.
       הערה: הגדרות קווי ההזרקה והדגימה, תכנות שיטת האיסוף ומנגנוני איזון הכלוב של מערכת דוגמי הדם האוטומטית תוארו בפירוט^20,21. המערכת שומרת על הצנתר פתוח על ידי אספקה אוטומטית של 10 μL של מי מלח הפריניזציה כל 20 דקות.
   12. הגדר את הזמן והתדירות של הדגימה לפני ההזרקה, ההזרקה ולאחר ההזרקה באמצעות תוכנת המחשב של המערכת. ראה שלב 3.1 להלן לקבלת ההגדרות הנוכחיות.
   13. המערכת מאפשרת לחיה לנוע בחופשיות מבלי לסבך את קווי הדגימה ו/או העירוי על-ידי חישת תנועת העכבר תוך סיבוב תא הדיור בכיוון הפוך לתנועת העכבר²¹ (איור 1).
   14. מלאו מחדש את העירוי או את קו ההזרקה בתרכובת והתחברו מחדש לצנתר הוורידי לפחות שעתיים לפני תחילת העירוי או ההזרקה.
       הערה: סיבוכים בניתוח עלולים להתרחש, ובעלי חיים צריכים להיות במעקב צמוד להחלמה ובימים שלאחר הניתוח. עיין בפרוטוקול בעלי החיים לקבלת ניטור נכון, דרישות סיום ונהלים.

3. איסוף דם אוטומטי והזרקה תוך ורידית

1. איסוף דם אוטומטי
   1. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש בנפח דגימה של 20.0 μL והגדר מרווח (כלומר, 7.0 דקות) בין כל דגימה לתדירות דגימה של כל 10.0 דקות לדגימה. הקצב המרבי הוא לדגום ברציפות 3.0 דקות לדגימה; נפח הדגימה המינימלי האפשרי הוא 5.0 μL. כמות שווה של מי מלח מוחזרת אוטומטית על ידי המערכת כדי להחליף את הדם שנדגם ולשמור על איזון נוזלי הגוף.
   2. הגדר את זמן הדגימה הכולל כ - 30 (t = -30 - 0) דקות לפני ו - 30 (t = 0 - 30) דקות לאחר הזרקה תוך ורידית של CNO (0.5 מ"ג/ק"ג, איור 2).
   3. כל דגימת דם שנאספת (20.0 μL) מדוללת אוטומטית ב-50 μL של מלח (המכיל הפרין ב-10 U/mL) ומאוחסנת בנפרד במיקרו-צינורית המוחזקת בקרוסלת דגימות בקירור על ידי המערכת.
2. הזרקה אוטומטית תוך ורידית
   1. נתק את הקו הוורידי מהקטטר הוורידי כדי למלא מחדש CNO (מינון מחושב בנפרד לפי נפח של ~50-60 μL ב 0.5 מ"ג / ק"ג) לפחות 2 שעות לפני תחילת דגימת הדם.
   2. משכו ידנית את התמיסה (מעט יותר מהנפח המחושב) מהקו לאחור עם מזרק ההזרקה, תוך השארת בועת אוויר קטנה בין התמיסה לבין המלח הקיים בשורה.
   3. חבר מחדש את קו ההזרקה לצנתר ורידי וקבע את קצב ההזרקה על 500 μL/min ואת זמן תחילת ההזרקה על 2 דקות לאחר סיום הדגימה t = 0. זמן ההזרקה הכולל לכל חיה הוא 5-6 שניות.
      הערה: במידת הצורך, התרכובת יכולה להיות מועברת גם על ידי הזרקה תוך צפקית ידנית (IP), אך הדבר ידרוש הפרעה לבעל החיים במהלך או לפני פרוטוקול איסוף הדם. אנחנו גם מראים את החלופה הזאת בתוצאות.

4. זילוח בעלי חיים ואיסוף מוח (אופציונלי)

הערה: יש לבצע הליך זה רק אם המוח נדרש לנתח את אתר המוח של הפעלה עצבית או תגובות במורד הזרם.

1. נתק את העכבר ממערכת איסוף הדם בסוף פרוטוקול האיסוף. שעתיים לאחר ההזרקה לווריד, המשיכו לנקב את בעל החיים עם 10% פורמלין חוצץ נייטרלי (NBF), בשיטה המועדפת או כמתואר במקום אחר²².
2. נתחו את המוח ושמרו אותו ב-20% סוכרוז ב-10%-NBF למשך 3 שעות כדי להמשיך בקיבוע.
3. לאחר 3 שעות, מעבירים את המוח המקובע ל-20% סוכרוז ב-PBS ושומרים בטמפרטורה של 4°C עד שהם מוכנים לחתך.
   הערה: הימנע מקיבוע יתר מכיוון שזה יסווה את האנטיגנים של cFOS. בתמיסת 20% סוכרוז, המוח צריך לשקוע לתחתית המיכל.
4. צור מקטעים באמצעות מיקרוטום מקפיא או קריוסטט והשתמש בשיטה המועדפת כדי להסתכל על הפעלה עצבית (למשל, cFOS immunohistochemistry מוצג).
   הערה: הנוגדנים המשמשים לתוצאות הנוכחיות מתוארים בטבלת החומרים.

5. עיבוד וניתוח דגימות

1. הסר דגימות דם מהדוגם האוטומטי מיד לאחר סיום הניסוי והנח אותן על קרח.
2. סובבו את הדגימות במשקל של 14,000 × גרם למשך 30 שניות.
3. לאסוף את הפלזמה. יש לאחסן אותו בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח.
4. בדוק את דגימות הדם על ידי LH ELISA כמתואר לפני^10,23.

Discussion

באמצעות פרוטוקול זה הצלחנו להראות פעימות LH בסיסיות והפרשת LH לאחר גירוי של אוכלוסייה עצבית. היתרונות הגדולים של המערכת הם הסביבה נטולת הלחצים בה מתבצעת הדגימה, ללא נוכחות או טיפול אנושי במהלך דגימת הדם. בנוסף, לא נדרשו אילוף מייגע קודם של בעלי חיים והסתגלות לנוכחות או לטיפול אנושי במהלך הניסוי. ניסויים קודמים באמצעות דגימת דם ידנית דרשו כמות גדולה של זמן ומאמץ כדי למזער את גורמי הלחץ ^7,31,32. עם זאת, חיתוך הזנב לבדו הוא גורם לחץ³³. יישום פרדיגמת סביבה לא מלחיצה ופרדיגמת אילוף במתקני בעלי חיים משותפים, שבהם הפרעות הן בלתי צפויות, עשוי גם הוא להיות אילוץ. במעבדות מסוימות, בעלי חיים לעתים קרובות צריך להיות מועבר לחדרי הליך חלופיים עבור דגימת דם. מגבלות אלה עשויות להפוך את השיטה הידנית ללא מתאימה לזיהוי שינויים עדינים ברמות LH, ולכן, גישה מעשית יכולה להיות מועילה במצבים אלה. הדגימה האוטומטית מתבצעת בחדר שקט שבו מניחים את העכברים מספר ימים מראש כדי להתאקלם בסביבה החדשה. הניסיון הקודם שלנו עם פרוטוקול זה סיפק זיהוי מדויק של דפוסי הפרשת קורטיקוסטרון והורמון גדילה פולסטילי בעכברים, ולא הראה רמות גבוהות של קורטיקוסטרון במהלך הדגימה האוטומטית¹⁵. בניסויים הנוכחיים, כל החיות הותאמו היטב למערכת הדגימה שהראתה בניית קן בתא הדגימה לאחר ~24 שעות וצבע שיער בהיר, מה שמצביע על היעדר סטרס ומצב בריאותי כללי טוב (איור 1).

הקושי העיקרי המוביל לתוצאות שליליות הוא כנראה מיקוד לא מתאים של AAV לאוכלוסייה העצבית הנדרשת. דיוק בזריקות הסטריאוטקסיות הוא חיוני ויש לבצע אימון מראש כדי לוודא את הקואורדינטות ואת נפחי ההזרקה. אימון יכול להיעשות על ידי הזרקת כמות קטנה של 0.5-1% אוונס כחול למיקום הרצוי בניתוח ללא התאוששות ולאחר מכן לקחת פרוסה של המוח שזה עתה נותח באמצעות מטריצת מוח עכבר (למשל, טד פלה) כדי לבדוק את האתר ואת גודל הזריקה באמצעות סטריאוסקופ.

חשוב גם לקחת בחשבון שדם ופלזמה שנאספו ממערכת דגימת הדם האוטומטית ידוללו במי מלח הפריניזציה (למשל, 20 מיקרוליטר דם ב-50 מיקרוליטר מי מלח בתוצאות שלנו)²⁰, וייתכן שיהיה צורך להתאים את יחס הדילול לרגישות השיטה האנליטית שנבחרה. בדקנו את רמות ה-LH בדם מלא המדולל ב-BSA-PBS (כפי שמומלץ עבור LH ELISA רגיש במיוחד)¹⁰ או במי מלח ולא מצאנו הבדלים בערכי LH. לא ניתן להשתמש בטווין במדלל מכיוון שזה יזרום למערכת הדם כדי לחלץ את הדגימות על ידי החלפת נוזלי הדגימה²⁰. מניסיוננו, דילולים של פחות מ-1:10 נתנו תוצאות LH טובות אך מעט לא העריכו נכון את רמות ה-LH בהשוואה ל-1:3.5. זה מצביע על כך שהדילול עשוי להיות מותאם עוד יותר כדי להפחית את כמות הדם שנאסף, במידת הצורך.

חלופה לאספקת תרכובת אוטומטית היא לבצע הזרקות ידניות דרך הצנתר הוורידי. במקרה זה, החוקר נמצא לזמן קצר בחדר כדי לספק את הזריקה. עם זאת, אין מגע ישיר עם בעלי החיים או עם מגוריהם וסביבתם, ובניגוד לזריקות תוך צפקיות או תת עוריות, ההליך כולו הוא לעתים קרובות מבלי לשים לב על ידי החיה. היתרונות של הזרקה ידנית הם שאין צורך להגדיר מראש את דילול התרכובת, מה שעשוי להיות קריטי עבור תרכובות יקרות מדי לשימוש בנפחים גדולים יותר או רגישות להתכלות לאורך זמן; מכיוון שנפח הפעולה קטן יותר מאשר במשלוח אוטומטי, שם יש למלא מראש את קו העירוי והצנתר בתמיסה מורכבת יותר.

דגימת דם אוטומטית מספקת הזדמנות ייחודית לחקור וריאציות LH במהלך השינה, למשל. אנו צופים באופן קבוע בבעלי חיים ישנים בקינים שלהם בזמן הדגימה. ניתן לקשר דגימה זו עם רישומי EEG כדי ליצור ניתוח מפורט יותר של הקשר בין פעילות עצבית לבין דפוס LH³⁴. כפי שמוצג כאן, האפשרויות לשימוש בדגימת דם אוטומטית הן רבות: החל מדגימת LH בסיסית לבדיקת תגובת LH לתרכובות אנדוגניות או אקסוגניות, או להפעלה או דיכוי של אוכלוסיות עצביות. המניפולציות העצביות יכולות להיות מיושמות בחריפות עם כימוגנטיקה או אופטוגנטיקה, או לצמיתות באמצעות מודלים של עכברים טרנסגניים וכלי השתקה אפופטוטיים או עצביים. דגימת דם אוטומטית מאפשרת גם מדידה של הורמונים אחרים בעלי דפוסי הפרשה פועמים מאוד (למשל, הורמון גדילה¹⁵). בנקבות עכברים, אם נדרש שלב מסוים של מחזור הייחום, ניתן לאסוף בזהירות מריחות נרתיקיות שעות לפני תחילת פרוטוקול²⁶ מבלי להפריע לקווי העירוי והדגימה. בעלי חיים יכולים להיות מחוברים למערכת הדגימה למשך 7-10 ימים כאשר הסיכון לקרישת קו העורקים עולה עם הזמן.

טכניקה זו, עם זאת, מוגבלת לשימוש בבעלי חיים יחידים, ולכן, היא עשויה שלא להתאים לחקר אינטראקציות חברתיות. היא גם פולשנית ודורשת ניתוח מאתגר מבחינה טכנית, כך שייתכן שלא ניתן יהיה ליישם אותה עם חיות צעירות או מודלים מסוימים של מחלות. לבסוף, מכיוון שעלות רכישת המערכת עשויה להיות גבוהה מדי עבור מעבדת מחקר בודדת, רצוי להקים אותה במעבדת ליבה המספקת את פרוטוקול הניסוי שהוזכר כשירותים.

לסיכום, פרוטוקול זה מראה כיצד לבצע משלוח סטריאוטקסי של AAV בשילוב עם דגימת דם אוטומטית. השליטה המרחבית והזמנית המדויקת המושגת בטכניקה זו, יחד עם גמישות היישום שלה על מודלים, פרוטוקולי מדידה והורמונים שונים, הופכים אותה לשיטה רבת עוצמה לחקר הבקרה ההורמונלית במכרסמים. והכי חשוב, השיטה מספקת סביבה נטולת מתח על ידי ביטול נוכחות אנושית וטיפול במהלך הזרקה ו / או דגימה, ואילוף קודם של בעלי חיים. יתרונות אלה, יחד עם האפשרות של ריבוב, הופכים שיטה זו לכלי ייחודי לחקר הבקרה העצבית של שינויים הורמונליים בעכברים מודעים, נעים בחופשיות וללא הפרעות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry	Addgene	44361	Not necessarily this virus but this was the one used for representative results
Alcohol			Disinfection
Anesthesia Induction box	Vetequip
Anesthesia induction machine	Kent Scientific Equipment	SomnoSuite
Anesthesia masks for mice	Kent Scientific Equipment	SOMNO-0801
Autoclip applier 9 mm	Clay Adams	427630
Autoclip remover 9 mm	Clay Adams	427637
Autoclips 9 mm	Clay Adams	427631
BASi Culex Controller	Culex	SN: 2151, 2152, 2156, 2158	4 stations
BASi Honey Comb Fraction Collector	Honey Comb	SN: 2105, 2106, 2107, 2108	4 stations
BASi Ratrun Rotation Control	RATURN 2	SN: 5680, 5681, 5682, 5683	4 stations
C57BL/6J mice		JAX # 000664
Carprofen	Zoetis	Rimadyl	Analgesic
Clippers	Braun
Clozapine-N-oxide	ENZO	BLM-NS105-0005
Cotton tipped applicators
CULEX Automated In Vivo Sampling System	BASi	DS000627	with CX-4000S Replacement Tubing Sets
Curved forceps serrated	FST	11151-10
Drill	Dremel	61100
Empis control Module	EMPIS CM	SN: 174
Empis Programmable Infusion System	EMPIS	SN: 2125 , 2126, 2127, 2128	With CX-7010S 4 BAS-2 Infusion Sets; 4 stations
Envigo 2016 diet			low-phytoestrogen diet
Eye ointment	Dechra	Puralube Vet Ointment	Petrolatum Ophtalmic oinment
Glass pipettes	World Precision Instruments	MIB100-6
Hemostats	Roboz Surgical	RS-7101
Iodine	Betadine Surgical scrub
Isoflurane	VetOne	Fluriso	Anesthetic
Isoflurane Vaporizer or SomnoSuite Low-Flow Anesthesia System	Surgivet or Kent Scientific Corp	SS-01	Anesthesia Machine
Kiss1-Cre;ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) mice		JAX # 023436 and #024109
Kisspeptin-10	Phoenix Pharmaceuticals	048-56
Micro-renathane tubing	Braintree Scientific	MRE025	Surgical catheterization
Micro-Scissors	Roboz Surgical	RS-5606
Needle Holder	Roboz Surgical	RS-7842
Picoliter injector	Warner Instruments	PLI-100A
Pipette puller	Sutter Instruments	P30
Rodent Warmer X2	Stoelting	53850
Scalpel	FST	10003-12
Scissors	Roboz Surgical	RS-6808
Silicon tubing	Liveo Laboratory Tubing	NO.508-001	0.012 in I.D x 0.025 in O.D.
Stereotaxic table	RWD	E06208
Sterile 0.9% saline	Baxter	2F7124
Sterile towel drapes	Dynarex	4410
Surgical blades	SKLAR	06-3011
Surgical stereoscope	Zeiss	f-160
Tweezers	Roboz Surgical	RS-4960
Tweezers	Roboz Surgical	RS-4972
Tweezers	Roboz Surgical	RS-5058
Antibodies
Anti-cFos	Millipore	ABE457	Antigen target: N-terminus cFos; Host organism: Rabbit; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2631318
Anti-GFP	Aves Labs	GFP-1010	Antigen target: recombinant GFP null; Host organism: Chicken; Dilution used: 1:10,000; RRID: AB_2307313
Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Labs	711-065-152	Antigen target: Rabbit IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:1,000; RRID: AB_2340593
Donkey anti-Rat IgG, AlexaFluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-21209	Antigen target: Rat IgG (H+L); Host organism: Donkey; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2535795
Goat anti-Chicken IgY, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11039	Antigen target: Chicken, IgY (H+L); Host organism: Goat; Dilution used: 1:500; RRID: AB_2534096
mCherry monoclonal (16D7)	Thermo Fisher Scientific	M11217	Antigen target: mCherry tag; Host organism: Rat; Dilution used: 1:5,000; RRID: AB_2536611