Isolamento Intestinal de Larvas de Zebrafish para Sequenciamento de RNA de Célula Única

Summary

Aqui, descrevemos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias após a fertilização, para análise de sequenciamento de RNA de célula única.

Abstract

O trato gastrointestinal (GI) desempenha uma série de funções essenciais para a vida. Defeitos congênitos que afetam seu desenvolvimento podem levar a distúrbios neuromusculares entéricos, ressaltando a importância da compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e disfunção gastrointestinal. Neste estudo, apresentamos um método para isolamento intestinal de larvas de zebrafish aos 5 dias pós-fertilização para obtenção de células vivas viáveis que podem ser usadas para análise de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq). Este protocolo baseia-se na dissecção manual do intestino do peixe-zebra, seguida de dissociação enzimática com papaína. Posteriormente, as células são submetidas à triagem celular ativada por fluorescência, e células viáveis são coletadas para scRNA-seq. Com esse método, conseguimos identificar com sucesso diferentes tipos de células intestinais, incluindo células epiteliais, estromais, sanguíneas, musculares e imunes, bem como neurônios entéricos e glia. Portanto, consideramos ser um recurso valioso para o estudo da composição do trato gastrointestinal na saúde e na doença, utilizando o peixe-zebra.

Introduction

O trato gastrointestinal (GI) é um sistema complexo que desempenha um papel vital na saúde geral e bem-estar. É responsável pela digestão e absorção de nutrientes, bem como pela eliminação de resíduos ^1,2. O trato gastrointestinal é composto por múltiplos tipos celulares, incluindo células epiteliais, células musculares lisas, células imunes e sistema nervoso entérico (ENS), que se comunicam estreitamente para regular e manter a função intestinal adequada ^3,4,5. Defeitos no desenvolvimento do trato gastrointestinal po....

Protocol

Toda a criação e experimentos de zebrafish foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais do Erasmus MC e legislação de bem-estar animal. O uso de larvas de peixe-zebra aos 5 dias após a fertilização se enquadra na categoria de experimentos que não exigem aprovação ética formal, conforme descrito pelos regulamentos holandeses.

1. Obtenção de 5 dias pós-fertilização (dpf) de larvas selvagens e tg(phox2bb:GFP)

1. Montar a reprodução.......

Discussion

Aqui, apresentamos um método para isolamento e dissociação do intestino de larvas de 5 dpf de zebrafish usando FACS. Com este método, diferentes tipos celulares intestinais foram coletados e analisados com sucesso por scRNA-seq, utilizando a plataforma 10x Genomics Chromium. Selecionamos a linhagem de zebrafish tg(phox2bb:GFP), pois queríamos uma indicação de que células viáveis do ENS também seriam isoladas (Figura 2D). No entanto, é importante notar que este método pod.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap	Falcon	352235
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat#D-9542
Dissection microscope	Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine	BD Biosciences	N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2	Gibco	14025050
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
L-Cysteine	Sigma	C7352
MS-222, Tricaine	Supelco	A5040-250G
Papain	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart et al. (2019)	N/A
Trypan blue	Sigma	Cat#T8154