הערכת ההשפעה של תרופות נוגדות שלשול ותמציות צמחים על Drosophila melanogaster

Summary

כאן, שיטה מתוארת להאכיל Drosophila melanogaster עם תרופות ותמציות צמחים ולהעריך את השפעתם על מערכת העיכול על ידי ניתוח זבובי פירות צואה פיקדונות. הזבובים שטופלו בתרופות יכולים לשמש כמודל למחקר נוסף.

Abstract

כדי לחקור את הפיזיולוגיה של מערכת העיכול האנושית, מדענים ביו-רפואיים הסתמכו על שימוש באורגניזמים לדוגמה. למרות שחוקרים רבים השתמשו בעכברים כמודל לחקר תפקוד המעי, רק דיווחים מעטים התמקדו בדרוזופילה מלנוגסטר (D. melanogaster). בהשוואה לעכברים, לזבובי הפירות יתרונות רבים, כגון מחזור חיים קצר, תחזוקה חסכונית ופשוטה, וללא בעיות אתיות. יתר על כן, הפיזיולוגיה של מערכת העיכול, האנטומיה ומסלולי האיתות של יונקים שמורים מאוד ב-D. melanogaster. תמציות צמחים שימשו באופן מסורתי לטיפול בשלשולים ועצירות. לדוגמה, Psidium guajava (P. guajava) הוא אחד החומרים נוגדי השלשול הידועים ביותר באזורים הטרופיים. עם זאת, אף מחקר לא העריך את ההשפעה של תרופות נוגדות שלשול ומשלשלות ותמציות צמחים ב- D. melanogaster, ועדיין לא ידוע אם השפעות דומות (למשל, מרבצי צואה קטנים יותר, מרוכזים יותר ושופעים פחות במקרה של תרופות נוגדות שלשול) יכולות להתרחש בזבובי הפירות בהשוואה ליונקים. במחקר זה, השפעה נוגדת שלשולים הנגרמת על ידי P. guajava מודגמת בזן D. melanogaster המציג פנוטיפ שלשול. דגימת צואה המיוצרת על ידי זבובים מנוטרת באמצעות מזון בתוספת צבע. פרוטוקול זה מתאר את השיטה המשמשת להכנת מזון עם תרופות, הערכת מרבצי הצואה של זבובים הניזונים מתכשירי מזון אלה, ופירוש הנתונים המתקבלים.

Introduction

מערכת העיכול (GI), המכונה גם מערכת העיכול, אחראית על העיכול והספיגה של חומרים מזינים והפרשת מוצרים לא מעוכלים¹. מערכת העיכול חשופה למגוון הפרעות שעלולות לגרום לאי נוחות, כאב ושיבוש בחיי היומיום. הפרעות במערכת העיכול כוללות כאבי בטן ואי נוחות, נפיחות, צרבת, קלקול קיבה או הפרעות בעיכול, בחילות, הקאות, שלשולים ועצירות². שלשול הוא התסמין השכיח ביותר של הפרעת GI³, והוא מוגדר כמחלה עם לפחות שלושה צואה רופפת ומימית במהלך תקופה של 24 שעות⁴. שלשול נגרם על ידי מגוון רחב של פתוגנים, כולל חיידקים, וירוסים, טפילים, פטריות, והוא יכול להיגרם גם על ידי תרופות ^5,6. ברחבי העולם, שלשול ממשיך להיות הגורם השני לתמותה בקרב ילדים מתחת לגיל^{5 7.} למרות שלשול יכול לפתור את עצמו, זה יכול גם להצביע על מצב בסיסי חמור יותר אם זה נמשך יותר מכמה ימים.

כדי לחקור את מערכת העיכול, חוקרים פונים למודלים של בעלי חיים כגון עכברים, חולדות וחזירים ^8,9. עם זאת, השימוש בבעלי חיים אלה יכול להיות יקר וגוזל זמן מכיוון שהם דורשים מתקנים מיוחדים ושיקולים אתיים. מחקרים אחרונים הראו כי D. melanogaster יכול לשמש כמודל לחקר מערכת העיכול ולחקור כמה מנגנונים כגון שמירה על הומאוסטזיס רגנרטיבי, התפתחות הזדקנות החיסון, אובדן תפקוד מחסום אפיתל, ואת הירידה בהומאוסטזיס מטבולי^10,11. D. melanogaster, המכונה זבוב הפירות, חולק רמה גבוהה של הומולוגיה גנטית עם בני אדם; מאמינים כי לכ-75% מהגנים של מחלות אנושיות יש הומולוג פונקציונלי בזבוב¹². יש להם גם מערכת עיכול פשוטה המורכבת ממעי קדמי, מעי בינוני ומעי אחורי¹³. D. melanogaster קל לתרבית במעבדה וניתן להנדס גנטית בדרכים שונות¹⁴. לכן, שימוש ב- D. melanogaster לבדיקת in vivo הוא כלי רב עוצמה המאפשר לחוקרים לחקור תהליכים ביולוגיים מורכבים בסביבה מבוקרת.

על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), כ -80% מהאנשים החיים במדינות מתפתחות משתמשים ברפואה מסורתית לצורכי הבריאות העיקריים שלהם¹⁵. השימוש הגבוה בצמחי מרפא יכול להיות מוסבר בכך שהם זמינים בקלות, זולים, ויש להם מעט תופעות לוואי¹⁶. חלקי הצמח העיקריים המשמשים בטיפול צמחי כוללים עלים, קליפה, שורשים, זרעים¹⁷ בעוד שיטות ההכנה העיקריות הן עירוי, מרתח ו maceration¹⁸. תרופות צמחיות אלה מכילות חומרים פיטוכימיים כגון אלקלואידים, טרפנואידים, פלבנואידים, סטרואידים, טאנינים ופחמימות¹⁹, שיש להם השפעות טיפוליות על גוף האדם. אנשים משתמשים במגוון צמחי מרפא לטיפול בהפרעות במערכת העיכול כגון שלשולים, כאבי בטן ודיזנטריה²⁰. לדוגמה, Psidium guajava הוא אחד הצמחים הנפוצים ביותר לטיפול בשלשולים בעולם. בדיקות פרמקולוגיות וקליניות שונות כבר הראו את בטיחותו, מה שהופך אותו מועמד טוב נגד שלשולים לחקור^21,22. עם זאת, המגבלות העיקריות של תרופות צמחיות הן חוסר יעילות והערכת בטיחות, כמו גם חוסר מידע מוגדר ומלא על הרכב תמציות צמחים בשימוש²³. כדי לאמת את היעילות והבטיחות של תרופות צמחיות, נדרשת גישה שיטתית הכוללת תיקוף ניסיוני וקליני והגישה צריכה להיות נתמכת על ידי מספיק נתונים ממחקרי in vivo ו- in vitro.

כדי להעריך תרופות מסורתיות על יעילותן בטיפול בשלשולים, השימוש בעכברים וחולדות היה דומיננטי בעשורים האחרונים^24,25. בשל היתרונות העיקריים שהוזכרו קודם לכן, כלומר, קלות שימוש, זול, לשכפל, שמורות פונקציות ספיגה ועיכול בין זבובים ויונקים, אנו מציעים להשתמש D. melanogaster כמודל להערכת פעילות נוגדת שלשולים של צמחים. הפנוטיפ השלשול ב- D. melanogaster יכול להיות מאופיין במספר תכונות, כולל שפע מוגבר של משקעי צואה, גדלי פיקדון גדולים יותר, צבע בהיר יותר (פחות מרוכז), וחומר צואה גבוה יותר²⁶. ניתן לכמת פנוטיפ זה באמצעות פרמטרים שונים: מספר משקעי צואה, שטח כולל של פיקדונות, בהירות ממוצעת, וצפיפות אופטית משולבת כוללת (IOD). סה"כ IOD מוגדר כתכולת הצבע הכוללת של המרבץ, כלומר סך כל החומר הצואתי המופרש²⁷. בעבר, בדיקה פותחה כדי לנתח פיקדונות צואה של ד melanogaster^27,28. בבדיקה זו, הקורא האולטימטיבי של גללים (T.U.R.D.) שימש ככלי ניתוח צואה, המאפשר לבדוק את מספר, גודל וקלילות של משקעי צואה ובכך לפקח על הפיזיולוגיה של המעי של זבובי הפירות. עם זאת, שיטה זו מעולם לא יושמה כדי להעריך את הפנוטיפ השלשול בזבובים. הגן Ion Transport Peptide (ITP) הוא מווסת אנדוקריני חשוב של צמא והפרשה ומשלב הומאוסטזיס מים עם הזנה ב-D. melanogaster. במחקר שנערך לאחרונה, הוכח כי מהירות מעבר המזון במערכת העיכול ותדירות אירועי עשיית הצרכים הופחתו על ידי ביטוי יתר של ITP ועלו על ידי הפלה של ITP. הפנוטיפ האחרון תואר כשלשול על ידי מחברי מחקר זה²⁹.

בפרוטוקול זה, גרסה שונה של בדיקת הפקדת צואה משמשת להערכת ההשפעה של סוכן נוגד שלשולים (כלומר, תמצית עלי גויאבה) על מערכת העיכול של D. melanogaster באמצעות זן ITPi כמודל שלשול. המטרה הכוללת של שיטה זו היא: 1) לספק שיטה קלה ואמינה להערכת ההשפעה נוגדת השלשולים של תרופות ותמציות צמחים, 2) לאפשר גילוי של תרכובות ביו-אקטיביות האחראיות להשפעה נוגדת השלשולים בתמציות צמחים על ידי יישום גישה מונחית ביואקטיביות.

Protocol

1. הכנת תמצית צמחים

1. לאסוף Psidium guajava L. עלים³⁰ מעץ בוגר ולעבד כדלקמן: לייבש את העלים בתנור ב 40 מעלות צלזיוס במשך 6 ימים, ולאחר מכן יבש באוויר במשך 6 ימים, ולאחר מכן יבש שוב בתנור ב 40 מעלות צלזיוס במשך 4 ימים, ולבסוף להכין אבקת עלים על ידי טחינת העלים היבשים בטחינה טחינה או מטחנת קפה.
2. מאצרט 100 גרם של אבקה מיובשת ב 1 L של 96% אתנול במשך 24 שעות, עם ערבוב מתמשך באמצעות שייקר. יש להעביר את שאריות הצמח לאותו תהליך פעם נוספת ולאדות את התסנין שנוצר ליובש באמצעות מאייד סיבובי ואקום בלחץ מופחת (175 mbar) ב-40°C.
3. ממיסים את תמצית הצמח באתנול כדי להשיג את הריכוז הרצוי. לקבוע את הריכוז האופטימלי (באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן) על ידי בדיקת סדרה של ריכוזים.
   1. עבור תמציות צמחים, בדקו טווח ריכוז של 100 מיקרוגרם/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל, 10 מ"ג/מ"ל, 100 מ"ג/מ"ל והשתמשו באלה שאינן משפיעות על שיעור ההישרדות של הזבוב. עבור תרכובות טהורות, בדוק את טווח הריכוזים הבא: 0.05, 0.5, 5 ו- 50 mM¹².

2. הכנת מדיום מזון

1. מודדים 100 מ"ל מים מזוקקים ויוצקים לתוך הכד עם 4 גרם סוכר ו-0.8 גרם אגר (ראו טבלת חומרים). מחממים ל-100°C (תוך כדי ערבוב) ומחזיקים למשך 10 דקות.
2. מנמיכים את הטמפרטורה ל 80 מעלות צלזיוס, מוסיפים 7.4 גרם קמח ו 2.8 גרם שמרים תוך כדי ערבוב. מחממים לפחות 20 דקות, עדיין מערבבים ושולטים בטמפרטורה אשר צריכה להיות סביב 80 מעלות צלזיוס.
3. מוסיפים היטב את תמיסת החומצה הפרופיונית של מולדקס (1 מ"ל מולדקס ו-0.3 גרם חומצה פרופיונית). המתינו עד שהטמפרטורה תרד לסביבות 50°C, הוסיפו את תמיסת תמצית הצמח (1 מ"ג/מ"ל) ו-0.5 גרם אבקת ברומופנול כחולה.
   הערה: עיין בסעיף 1.3.1 לקבלת פרטים נוספים על הריכוזים האחרים שיש לבדוק.
4. מזגו את האוכל לצלחות הפטרי ועצרו כאשר צלחת הפטרי מלאה (איור 1A). מניחים לצלחות הפטרי להתקרר לטמפרטורת החדר (כ-3 שעות), סוגרים את המכסה ומאחסנים במקרר בטמפרטורה של 4°C.
   הערה: יש לאחסן צלחות פטרי במקרר לא יותר משבועיים כדי למנוע אידוי מים.

איור 1: הדגמה של תהליך הניסוי לבדיקת משקעי צואה. (A) תמונה המציגה צלחות פטרי מלאות במדיום מזון. דאגו שיהיה מספיק אוכל בצלחת הפטרי, כך שלא יהיו רווחים שילכדו את הזבובים וימנעו מהם לזוז. עם זאת, אין להעמיס את צלחת פטרי עם מזון, כך פני השטח יכול להיות מכוסה באופן שווה. (ב) תמונה של המרית כמתואר בפרוטוקול. (ג) תמונה של בדיקת הפקדת הצואה כמתואר בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הכנת זבובים

1. הכינו את מיכלי CO₂ , אקדח ניפוח CO₂ עם מחטים, משטח זבוב, מברשת צבע ומיקרוסקופ. תחנת הזבוב מספקת CO₂ הן למשטח הזבוב והן לאקדח הניפוח. משטח הזבובים משמש למיון זבובים, ואילו אקדח הנשיפה CO₂ משמש להרדים זבובים בבקבוקונים, בקבוקים וצלחות פטרי.
2. תקננו את גיל הזבובים על ידי בחירת בקבוקונים המכילים גלמים (לפחות 10) והשליכו את הזבובים הבוגרים מהצינור בשיטה הבאה. בזה אחר זה, הופכים את הבקבוקונים ומכניסים את המחט בין פקק הכותנה לדופן הבקבוקון. מרדימים זבובים בוגרים עם אקדח הנשיפה CO₂ עד שכל הזבובים ישנים על תקע הכותנה (יש צורך בכמה שניות כדי להרדים אותם, ופעולת ההרדמה תימשך מספר שניות לאחר שחרור אקדח הנשיפה). פתחו את הבקבוקון מעל בקבוק זכוכית המכיל 70% אתנול וזרקו לתוכו את הזבובים. סגור את הבקבוקון עם תקע כותנה ולשמור אותו באינקובטור ב 25 ° C עם 60% לחות. הגדר את מחזור האור של האינקובטור ל- 12 שעות אור / 12 שעות כהות.
3. לאחר הדגירה (מקסימום 8 שעות), ממיינים אותם לנקבות וזכרים בתולים תחת המיקרוסקופ ומשטח זבובים על ידי סיבובם על גבם והסתכלות על איברי המין שלהם.
   1. איברי המין הנקביים חיוורים בהשוואה לאיברי המין הגבריים, שהם בצבע אדמדם. ניתן לזהות זכרים גם על ידי נוכחות של זיפים כהים, הנקראים מסרקות מין, על זוג רגליהם הקדמיות. מחלקים את הזבובים לשני צינורות טריים (אחד לזכרים ואחד לנקבות) ודגרים עליהם במשך 6-8 ימים ב 25 מעלות צלזיוס.
      הערה: ב 25 °C (75 °F), הנקבות נשארות בתוליות במשך כ 8 שעות לאחר הבקיעה.

4. בדיקת הפקדת צואה

1. תייגו את צלחות הפטרי עם הזן, המין והסם המתאימים כדי למנוע בלבול בין צלחות הפטרי. ערמו את צלחות הפטרי זו על גבי זו.
2. קבלו את צלחות הפטרי המכילות את המזון הצבוע והפכו אותן על נייר הניקוי כדי לספוג את הנוזלים העודפים. בעזרת מרית (איור 1B), חתכו את המזון ל-12 חלקים שווים ואז השתמשו במרית כדי להכניס פרוסה אחת לתוך צלחת פטרי ריקה.
   הערה: בהתאם למספר העותקים המשוכפלים, ניתן להגדיל את מספר הפרוסות שיש לחתוך עד 20 לכל צלחת פטרי. כל פרוסה צריכה להיות באותו גודל.
3. מרדימים את הזבובים עם_CO2 עד שכל הזבובים ישנים על פקק הכותנה. העבירו שישה זבובים בריאים בכל צלחת פטרי (איור 1C), סגרו את המכסה מיד, ואז הניחו אותם באינקובטור (25°C, 60% לחות, 12 שעות בהירות/ 12 שעות כהות).
4. כדי להבטיח שהזבובים לא יברחו מצלחת הפטרי במהלך הניסוי, חברו את הכיסוי העליון והתחתון של צלחת הפטרי בעזרת סרט הדבקה. עבור כל קבוצת בדיקה, הכינו שש צלחות פטרי משוכפלות (לפחות).
5. לאחר שאפשרו לזבובים לחזור לאחור במשך 24 שעות, השתמשו ב-CO2 כדי להרדים אותם, העבירו את הזבובים למיכל מלא באתנול 70% והשליכו את שאריות המזון.
6. שמרו את צלחות הפטרי והמשיכו לשלב 5.

5. כימות צלחות פטרי

1. הגדר תיקייה במחשב ושנה את שמה, על-ידי הכללת שם זן הניסוי, מין הזבובים וסוג התרופות שבהן נעשה שימוש. בתוך תיקיה זו, צור תיקיות משנה בשם Original, Cut ו- Analysis.
2. סרוק את צלחות Petri באמצעות סורק ברזולוציה גבוהה עם רזולוציה אופטית של 6,400 פיקסלים לאינץ' (ppi). סרוק את המכסה העליון והתחתון של כל צלחת פטרי בנפרד על ידי מיקומם בנפרד במרכז שדה הסורק.
3. פתח את היישום המותקן במחשב. חלון פתיחה ייפתח על מסך המחשב עם כל ההגדרות הכלליות (איור 2A).
   הערה: אל תשנה את ההגדרות המתקדמות. שלב זה תקף רק עבור משתמשים בעלי אותו סורק כפי שמוצע בטבלת החומרים. עיין בהנחיות אם אתה משתמש בתוכנה אחרת.
   1. תן שם לצלחת הפטרי ביישום, על ידי הכללת מספר רצף, כריכה עליונה או תחתונה, מין וסוג המזון שבו נעשה שימוש. בחר את ערכת תיקיית המשנה המקורית בשלב 5.1.
   2. תצוגה מקדימה של צלחת הפטרי. לחץ על תצוגה מקדימה בתחתית החלון, המתן מספר שניות עד שהסורק יסרוק מראש, ואז יופיע חלון על מסך המחשב. הזיזו את הריבוע המוצג על המסך כדי להקיף את צלחת הפטרי.
   3. לחץ על סריקה בפינה השמאלית התחתונה של החלון במסך המחשב, הסריקה נשמרת אוטומטית כתמונה בתיקייה הנבחרת.
4. חתוך את התמונה באמצעות יישום (למשל, יישום קוד פתוח פיג'י), כך שאף חפצים ושאריות מזון לא ייחשבו כפיקדונות.
   הערה: השלבים הבאים תקפים רק עבור משתמשים בעלי יישום פיג'י. עיין בהנחיות אם אתה משתמש בתוכנה אחרת.
   1. פתח את היישום פיג'י, המתן מספר שניות עד שיופיע סרגל כלים על המסך.
   2. גררו את התמונה לחיתוך אל סרגל הכלים. בחר את הסמל השלישי בחירות מצולע בסרגל הכלים, חתוך את החלק הלא רצוי של התמונה (תרשים העוגה הצבעוני) על ידי לחיצה על המסך כדי לסמן זווית סביב תרשים העוגה (איורים 2B-1,2).
      הערה: בשעת תיחום אזור החיתוך בתמונה, הכרחי שהמסגרות שנבחרו יחוברו בצורה חלקה מקצה לקצה.
   3. לחצו על 'עריכה' בפינה השמאלית העליונה של הסרגל ולאחר מכן על מילוי/ניקוי בחוץ (איור 2B-3).
   4. כדי לשמור את התמונה, לחץ על קובץ בפינה השמאלית העליונה של הסרגל, לאחר מכן על שמירה בשם ולבסוף על Tiff. בחר את תיקיית המשנה גזור קבוצה בשלב 5.1.
      הערה: בשעת שמירת התמונה החתוכה, ודא שאין תווים מיוחדים (לדוגמה, !, &, $, #, _,-,...) או תווים רבים מדי בשם הקובץ .

איור 2: שלבים מרכזיים בתהליך ניתוח הנתונים מבדיקת הפקדת צואה. (A) צילום מסך המציג את פרטי ההגדרה של יישום הסריקה. (B) תמונות שנחתכו באמצעות היישום Fiji. יש לוודא כי אין חפצים ושאריות מזון נחשבים פיקדונות. (C) צילום מסך המראה כיצד הוא נראה בעת פתיחת היישום Excel_merge-v4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

6. זיהוי משקעי צואה באמצעות הקורא האולטימטיבי של תוכנת קוד פתוח גללים

הערה: ניתן למצוא את המבוא והשימוש של הקורא האולטימטיבי של תוכנת גללים בקובץ משלים 1.

1. ראשית, פתח את תוכנת T.U.R.D. (איור משלים 1). צור ניסוי חדש ותן שם למסמך, ולאחר מכן שמור אותו בתיקיית המשנה ניתוח שהוגדרה בשלב 5.1.
2. לחץ על צלחות ולאחר מכן על הוסף צלחת. בחר את צלחת פטרי לעיבוד. מופיע חלון חדש עם שמות הלוחות שנבחרו ופרמטרים חדשים. הגדר את גודל הגוש, ההסטה, הגודל המינימלי והגודל המרבי (איור משלים 2).
3. כדי לוודא שמשקעי הצואה שזוהו הם הנכונים, לחצו על צלחות, לאחר מכן בדקו את הלוחות שנבחרו, לאחר מכן גרפיקה, וצפו בתמונות מבוארות (איור משלים 3). התקרבו והתבוננו בספירות. אם יש רק כמה פיקדונות שלא צריכים להיכלל בניתוח, בטל את הבחירה בפיקדונות שיוחרגו (איור משלים 4).
4. כדי שכל תמונה חדשה תעובד, הפעל מחדש משלב 6.3.
5. לאחר ניתוח הלוחות באמצעות תוכנת T.U.R.D, שנה את מספר הזבובים על ידי לחיצה על No. זבובים (איור משלים 5).
6. שנה את שם הקבוצה על-ידי לחיצה על לוחות > ערוך קבוצות > הוסף ולאחר מכן, בעמודה קבוצה , בחר את שם הקבוצה.
7. יצא את הנתונים המשוכפלים השונים בנפרד על ידי לחיצה על נתח סטטיסטיקה תיאורית > > בחר קבוצה (איור משלים 6). שמור את כל קבצי הגליונות האלקטרוניים (.csv) באותה תיקיה.
8. כדי לאסוף את כל הקבצים (שהושגו בשלב 6.7) בגיליון אלקטרוני ייחודי, פתח את היישום Excel_merge-v4 (קובץ קידוד משלים 1), המתן עד שיופיע המשפט הבא בחר את נתיב התיקיה (עם קבצי .csv):, ולאחר מכן הדבק את כתובת התיקיה לעיל. לדוגמה, הנתיב יכול להיות C:\Experiment\Fecal deposit test\ ולאחר מכן לחץ על Enter פעמיים במקלדת (איור 2C). לאחר מכן, קובץ גיליון אלקטרוני חדש נוצר באותה תיקייה. קובץ הגיליון האלקטרוני החדש כולל את כל הקבצים המיוצאים בגיליונות שונים.
9. בקובץ הגיליון האלקטרוני הקודם, הוסף גיליון נוסף כדי לאסוף את הממוצע של כל פרמטר של כל העותקים המשוכפלים (השתמש בפונקציה VLOOKUP לעיבוד הנתונים). דוגמה לכך מובאת בטבלה משלימה 1.
10. נתח את ערך p.

Discussion

D. melanogaster מקובל כמודל לתהליכים ביולוגיים שונים בשל הדמיון בגנים בין D. melanogaster לבני אדם³⁶. השימוש ב- D. melanogaster כמודל לחקר מערכת העיכול נפוץ והיישום של T.U.R.D. שימש להערכת מספר, שטח וכמות משקעי צואה. עם זאת, שיטת הזיהוי הפנוטיפית לא שימשה להערכת השלשולים בזבובי פירות. לכן, פרוטוקול זה מציג שיטה חדשה להעריך בערך את נוכחותם של שלשולים על ידי גילוי פיקדונות צואה.

פיקדונות צואה הם אינדיקטור חיוני לתפקוד מערכת העיכול ובריאות³⁷. בהקשר זה, מוצעת שיטה לגידול D. melanogaster על מדיום המכיל תרופות כדי לחקור פרמטרים שונים של משקעי צואה. על ידי מעקב אחר מספר הפיקדונות, ניתן לקבוע את תדירות הצואה ולהעריך אם לתרופה יש השפעה כלשהי על מעבר המעיים. ניתן למדוד את השטח הכולל של הפיקדונות כדי להעריך את הריכוז והדילול של חומר צואתי, שהוא גורם חשוב בקביעת הבריאות הכללית של מערכת העיכול. בנוסף, ניתן להשתמש בצפיפות האופטית המשולבת הכוללת (IOD) כדי לזהות את הכמות הכוללת של חומר צואה הקיים בפיקדונות. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לסינון והערכה של תרופות, כמו גם תמציות צמחים המשפיעות על מערכת העיכול. כאשר D. melanogaster משמש כאורגניזם מודל, ניתן להעריך את היעילות של תרופות פוטנציאליות, אשר יכול לעזור להאיץ את תהליך גילוי התרופה. על ידי יישום שיטה זו על תמציות צמחים, חוקרים יכולים לעזור לאמת את השימוש בהם כחומרים נוגדי שלשול.

ישנם מספר צעדים קריטיים שיש לקחת בחשבון בעת שימוש בפרוטוקול זה כדי לחקור משקעי צואה ב- D. melanogaster. ראשית, חיוני לחשב את המסה הנדרשת כדי להשיג את הריכוז הרצוי של התרופה בתווך. יתר על כן, חשוב להבטיח מצב הכנה טוב בעת הוספת התרופה למדיום, שכן טמפרטורות גבוהות יכולות לפגוע בתרופה ולהשפיע על עוצמתה. שנית, בחירת נקבות הזבובים חשובה בפרוטוקול זה. חשוב להשתמש בזבובים נקבות בתולות כדי למנוע את ההבדלים בתפוקת הצואה בין נקבות בתולות לנקבות מזווגות. לדוגמה, הכתמים המיוצרים על ידי נקבות בתולות הם עגולים יותר מאשר נקבות מזווגות, ונקבות מזווגות נוטות להפריש יותר חומר צואתי מאשר נקבות בתולות^27,28. לכן, מומלץ לאסוף זבובים לפני 8 שעות של eclosion כדי להבטיח כי כל הנקבות שנאספו הן בתולות. בנוסף, הזבובים שנבדקו צריכים להיות חזקים ובריאים, שכן בריאותם יכולה להשפיע על צריכת המזון ותפוקת הצואה. לדוגמה, זבובים בעלי צורה לא תקינה של כנפיים עשויים להתקשות להשיג את המזון. לבסוף, כדי להשתמש ב- T.U.R.D. בהצלחה, גודל הבלוק (פיקסלים) והגדרות ההסטה הם קריטיים. בשל ההבדל בניגודיות האור של התמונות, ייתכן שיהיה צורך לנסות הגדרות שונות כדי להשיג את הזיהוי הטוב ביותר האפשרי של פיקדונות צואה.

למרות שהשיטה המוצגת יעילה, ישנן מספר מגבלות. האחד הוא דיוק ריכוז התרופה בתווך. כמו המדיום מחומם במהלך ההכנה, כמה מים עשויים להתאדות, אשר יכול להשפיע על ריכוז התרופה. מגבלה נוספת היא סריקת צלחות הפטרי. חלקים מסוימים של צלחות פטרי (כלומר, קצוות) אינם נסרקים, וזה עלול לגרום לחישוב שגוי של סך משקעי הצואה. בנוסף, הזבובים אינם מייצרים את אותה כמות של משקעי צואה על הכיסויים העליונים והתחתונים של צלחות הפטרי. מכיוון שהם נוטים לייצר יותר פיקדונות על הכריכה התחתונה, סטיית התקן של הניתוח בין הכריכה העליונה והתחתונה עשויה להיות גבוהה, מה שעשוי להשפיע על דיוק התוצאות.

באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים יכולים לחקור שלשולים ב - D. melanogaster. על ידי שינוי המדיום המכיל תרופה, שיטה זו יכולה לשמש לסינון צמחים נוגדי שלשול, אשר מספק גישה חדשנית לגילוי תרופות. רפואה מסורתית ומוצרים טבעיים שימשו במשך מאות שנים לטיפול במחלות שונות, כולל הפרעות במערכת העיכול. על ידי שימוש בפרוטוקול זה כדי להעריך את היעילות של תמציות צמחים על משקעי צואה, ניתן לזהות טיפולים חדשים פוטנציאליים להפרעות בדרכי העיכול ולספק רציונל מדעי לשימוש בהם כתרופות נוגדות שלשול. גישה זו יכולה לספק תרומה רבת ערך לתחום גילוי תרופות ואתנופרמקולוגיה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical & Food medium
Agar	Sigma Aldrich	A7002	5 Kg bucket
Bromophenol blue	Sigma Aldrich	34725-61-6	B5525-25G
Corn flour	Nature et Cie	*910007	25 Kg bag
Crofelemer	Napo pharmaceuticals	-	-
Ethanol 96%	-	-	-
Loperamide	Sigma Aldrich	L4762	5 grams
Moldex	VWR	1.06757.5000	5 Kg bag
Propionic acid	Dutscher	409553-CER	1 Liter bottle
Sugar	Pomona EpiSaveurs	52705	1 Kg bag
Yeast	Dutscher	789195	10 Kg bag
Materials
Beaker	DWK LIFE SCIENCE	-	250 mL
Centrifugation tube	Eppendorf	30119401	Eppendorf tubes  5.0 mL
CO2 tank	-	-	-
Erlen Meyer flask	-	-	500 mL (for extraction)
Filter paper grade	Whatman	-	3 mm chr.
Flowbuddy socle	Genesis	-	-
Flugs Narrow Plastic vials	Genesis	49-102	-
Flystuff Blow gun	Genesis	-	-
Flystuff Ultimate Flypad	Genesis	-	-
Flystuff Foot pedal	Genesis	-	-
Forceps	Dumostar	11295-51	-
Graduated cylinder	-	-	100 mL
Inox spatula	-	-	-
Micropipette	Eppendorf	4924000088	Eppendorf Reference 2
Micropipette tip	Eppendorf	30000919	epT.I.P.S. Standard
Narrow Drosophila vials	Genesis	32-120	-
Paintbrush	-	-	-
Petri dish	Greiner	628162	Size: 60 x 15mm
Round-bottom flask	-	-	500 mL (for evaporation)
Thermometer	Avantor	620-0916
Whisk	-	-	-
Equipments
Chiller	HUBER	Minichiller	-
Heating bath	BÜCHI	B-490	-
Heating plate	BIOBLOCK SCIENTIFIC	-	Magnetic stirrer hot plate
Incubator	Memmert	-	HPP110eco
Rotary evaporator	BÜCHI	R-200	-
Scanner	Epson	V850 pro	-
Shaker	Edmund Bühle	KS 10	-
Stereomicroscope binocular	Zeiss	Stemi 305	-
Vacuum pump	VACUUBRAND	PC500 series	-
Vortex mixer	Sigma Aldrich	CLS6776-1EA	Corning LSE vortex mixers
Weighing scale	OHAUS Scout	SKX622	-