Avaliação do Efeito de Drogas Antidiarreicas e Extratos Vegetais sobre Drosophila melanogaster

Summary

Aqui, um método é descrito para alimentar Drosophila melanogaster com drogas e extratos de plantas e avaliar seu efeito no trato gastrointestinal através da análise dos depósitos fecais de moscas-das-frutas. As moscas tratadas com drogas podem ser usadas como modelo para futuras pesquisas.

Abstract

Para estudar a fisiologia gastrointestinal humana, os cientistas biomédicos confiaram no uso de organismos modelo. Embora muitos pesquisadores tenham usado camundongos como modelo para estudar a função intestinal, apenas alguns relatos se concentraram em Drosophila melanogaster (D. melanogaster). Comparadas aos camundongos, as moscas-das-frutas apresentam muitas vantagens, como ciclo de vida curto, manutenção simples e econômica, e sem problemas éticos. Além disso, a fisiologia, anatomia e vias de sinalização gastrointestinais de mamíferos são altamente conservadas em D. melanogaster. Extratos de plantas têm sido usados tradicionalmente para tratar diarreia e constipação. Por exemplo, Psidium guajava (P. guajava) é um dos agentes antidiarreicos mais conhecidos nos trópicos. No entanto, nenhum estudo avaliou o efeito de drogas antidiarreicas, laxantes e extratos de plantas em D. melanogaster, e permanece desconhecido se efeitos semelhantes (por exemplo, depósitos fecais menores, mais concentrados e menos abundantes no caso de drogas antidiarreicas) podem ocorrer nas moscas-das-frutas em comparação com mamíferos. Neste estudo, um efeito antidiarreico induzido por P. guajava é demonstrado em uma cepa de D. melanogaster que apresenta fenótipo diarreico. A amostragem fecal produzida pelas moscas é monitorada usando um alimento suplementado com corante. Esse protocolo descreve o método utilizado para o preparo dos alimentos com medicamentos, avaliação dos depósitos fecais das moscas alimentadas com essas preparações alimentares e interpretação dos dados obtidos.

Introduction

O trato gastrointestinal (GI), também chamado de trato digestivo, é responsável pela digestão e absorção de nutrientes e excreção de produtos não digeridos¹. O trato gastrointestinal é vulnerável a uma série de distúrbios que podem causar desconforto, dor e interrupção da vida diária. Os distúrbios gastrointestinais incluem dor e desconforto abdominal, distensão abdominal, azia, indigestão ou dispepsia, náuseas, vômitos, diarreia e constipação². A diarreia é o sintoma mais comum do distúrbio gastrointestinal³ e é definida como uma doença com pelo menos três fezes soltas e aquosas durante um período de 24 h⁴. A diarreia é causada por uma ampla gama de patógenos, incluindo bactérias, vírus, parasitas, fungos, e também pode ser causada por drogas ^5,6. No mundo, a diarreia continua sendo a segunda causa de mortalidade em crianças menores de 5^anos7. Embora a diarreia possa se resolver, também pode indicar uma condição subjacente mais grave se durar mais do que alguns dias.

Para estudar o trato intestinal, os pesquisadores recorrem a modelos animais como camundongos, ratos e porcos ^8,9. No entanto, o uso desses animais pode ser caro e demorado, pois requerem instalações especializadas e considerações éticas. Estudos recentes têm demonstrado que D. melanogaster pode ser utilizada como modelo para estudar o trato gastrointestinal e investigar alguns mecanismos, como a manutenção da homeostase regenerativa, o desenvolvimento da senescência imunológica, a perda da função de barreira epitelial e o declínio da homeostase metabólica^10,11. D. melanogaster, conhecida como mosca-da-fruta, compartilha um alto grau de homologia genética com os seres humanos; Acredita-se que aproximadamente 75% dos genes de doenças humanas tenham um homólogo funcional na mosca¹². Eles também têm um sistema digestivo simples composto por um intestino anterior, um intestino médio e um intestino posterior¹³. D. melanogaster é de fácil cultivo em laboratório e pode ser geneticamente modificada de diferentes maneiras¹⁴. Portanto, o uso de D. melanogaster para testes in vivo é uma ferramenta poderosa que permite aos pesquisadores estudar processos biológicos complexos em um ambiente controlado.

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), cerca de 80% das pessoas que vivem em países em desenvolvimento utilizam a medicina tradicional para suas necessidades primárias de saúde¹⁵. A alta utilização de plantas medicinais pode ser explicada pela facilidade de disponibilidade, baixo custo e poucos efeitos colaterais¹⁶. As principais partes da planta utilizadas na fitoterapia incluem folhas, cascas, raízes, sementes¹⁷, enquanto os principais métodos de preparo são a infusão, decocção e maceração¹⁸. Esses fitoterápicos contêm substâncias fitoquímicas como alcaloides, terpenóides, flavonoides, esteroides, taninos e carboidratos¹⁹, que têm efeitos terapêuticos no corpo humano. As pessoas utilizam uma variedade de plantas medicinais para tratar distúrbios gastrointestinais, como diarreia, dor de estômago e disenteria²⁰. Por exemplo, Psidium guajava é uma das plantas mais usadas para tratar diarreia no mundo. Vários testes farmacológicos e clínicos já demonstraram sua segurança, o que o torna um bom candidato antidiarreico para estudo^21,22. No entanto, as principais limitações dos fitoterápicos são a falta de avaliação de eficiência e segurança, bem como a falta de informações definitivas e completas sobre a composição dos extratos vegetais utilizados²³. Para validar a eficácia e a segurança de fitoterápicos, é necessária uma abordagem sistemática envolvendo validação experimental e clínica e a abordagem deve ser apoiada por dados suficientes de estudos in vivo e in vitro.

Para avaliar a eficácia dos remédios tradicionais no tratamento da diarreia, o uso de camundongos e ratos tem sido predominante nas últimas décadas^24,25. Devido às principais vantagens citadas anteriormente, ou seja, facilidade de uso, funções absortivas e digestivas acessíveis, replicáveis, conservadas entre moscas e mamíferos, propomos utilizar D. melanogaster como modelo para avaliar a atividade antidiarreica de plantas. O fenótipo diarreico em D. melanogaster pode ser caracterizado por várias características, incluindo maior abundância de depósitos fecais, maiores tamanhos de depósito, coloração mais clara (menos concentrada) e maior material fecal²⁶. Esse fenótipo pode ser quantificado usando vários parâmetros: número de depósitos fecais, área total dos depósitos, luminosidade média e densidade óptica total integrada (DIO). O IOD total é definido como o conteúdo total de corante do depósito, ou seja, o material fecal total excretado²⁷. Previamente, um ensaio foi desenvolvido para analisar depósitos fecais de D. melanogaster^27,28. Neste ensaio, o leitor final de fezes (T.U.R.D.) foi utilizado como ferramenta de análise fecal, que permite verificar o número, tamanho e luminosidade dos depósitos fecais e, assim, monitorar a fisiologia intestinal das moscas-das-frutas. No entanto, este método nunca foi aplicado para avaliar o fenótipo diarreico em moscas. O gene Ion Transport Peptide (ITP) é um importante regulador endócrino da sede e excreção e combina a homeostase da água com a alimentação em D. melanogaster. Em um estudo recente, demonstrou-se que a velocidade do trânsito alimentar através do trato gastrointestinal e a frequência de eventos de defecação foram diminuídas pela superexpressão de PTI e aumentadas pelo knockdown de PTI. Este último fenótipo foi descrito como diarreico pelos autores deste estudo²⁹.

Neste protocolo, uma versão modificada do ensaio de depósito fecal é empregada para avaliar o efeito de um agente antidiarreico (i.e., extrato de folha de goiaba) sobre o trato gastrintestinal de D. melanogaster usando a cepa ITPi como modelo diarreico. O objetivo geral deste método é: 1) fornecer um método fácil e confiável para avaliar o efeito antidiarreico de drogas e extratos vegetais, e 2) permitir a descoberta de compostos bioativos responsáveis pelo efeito antidiarreico em extratos de plantas através da aplicação de uma abordagem guiada por bioatividade.

Protocol

1. Preparação do extrato vegetal

1. Coletar folhas de Psidium guajava L.³⁰ de uma árvore adulta e processar da seguinte forma: secar as folhas em estufa a 40 °C por 6 dias, depois secar ao ar por 6 dias, depois secar novamente na estufa a 40 °C por 4 dias e, finalmente, preparar o pó da folha moendo as folhas secas em um moinho ou moedor de café.
2. Macerar 100 g do pó seco em 1 L de etanol 96% por 24 h, com agitação contínua com agitação. Submeter novamente o resíduo vegetal ao mesmo processo e evaporar os filtrados resultantes à secura utilizando um evaporador rotativo a vácuo sob pressão reduzida (175 mbar) a 40 °C.
3. Dissolva o extrato vegetal em etanol para obter a concentração desejada. Determinar a concentração ótima (usando o protocolo descrito aqui) testando uma série de concentrações.
   1. Para extratos vegetais, testar uma faixa de concentração de 100 μg/mL, 1 mg/mL, 10 mg/mL, 100 mg/mL e usar aqueles que não afetam a taxa de sobrevivência da mosca. Para os compostos puros, testar a seguinte gama de concentrações: 0,05, 0,5, 5 e 50 mM¹².

2. Preparação do meio alimentar

1. Medir 100 ml de água destilada e deitar no copo com 4 g de açúcar e 0,8 g de ágar (ver Tabela de Materiais). Aqueça a 100 °C (mexendo) e segure por 10 min.
2. Abaixe a temperatura para 80 °C, adicione 7,4 g de farinha e 2,8 g de fermento enquanto agita. Aqueça por pelo menos 20 min, ainda mexendo e controlando a temperatura que deve ficar em torno de 80 °C.
3. Adicionar a solução de ácido moldex-propiónico (1 ml de moldex e 0,3 g de ácido propiónico misturar bem). Aguarde a temperatura baixar para cerca de 50 °C, adicione a solução de extrato vegetal (1 mg/mL) e 0,5 g de azul de bromofenol em pó.
   NOTA: Consulte o ponto 1.3.1 para obter mais informações sobre as outras concentrações a ensaiar.
4. Despeje o alimento nas placas de Petri e pare quando a placa de Petri estiver cheia (Figura 1A). Deixe as placas de Petri arrefecer até à temperatura ambiente (cerca de 3 h), feche a tampa e guarde no frigorífico a 4 °C.
   NOTA: As placas de Petri devem ser armazenadas na geladeira por no máximo 2 semanas para evitar a evaporação da água.

Figura 1: Demonstração do processo experimental para o teste de depósito fecal. (A) Imagem mostrando placas de Petri cheias de meio alimentício. Certifique-se de ter comida suficiente na placa de Petri, para que nenhuma lacuna irá prender as moscas e impedi-las de se mover. No entanto, não sobrecarregue a placa de Petri com alimentos para que a superfície possa ser coberta uniformemente. (B) Imagem da espátula conforme descrito no protocolo. (C) Imagem do teste de depósito fecal conforme descrito no protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparação das moscas

1. Prepare os tanques CO₂ , pistola de sopro CO₂ com agulhas, almofada de mosca, pincel e microscópio. A estação de mosca fornece CO₂ tanto para a almofada de mosca quanto para a pistola de avarpro. A almofada de mosca é empregada para classificar moscas, enquanto a zarabatana CO₂ é utilizada para anestesiar moscas em frascos, garrafas e placas de Petri.
2. Padronize a idade das moscas selecionando frascos que contenham pupas (pelo menos 10) e descarte as moscas adultas do tubo usando o seguinte método. Um a um, vire os frascos para injetáveis de cabeça para baixo e introduza a agulha entre o tampão de algodão e a parede lateral do frasco. Anestesiar moscas adultas com a zarabatana CO₂ até que todas as moscas estejam dormindo no tampão de algodão (alguns segundos são necessários para anestesia-las, e a ação anestésica durará alguns segundos após a liberação da zarabatana). Abra o frasco para injetáveis acima de um frasco de vidro contendo etanol a 70% e coloque as moscas nele. Feche o frasco para injetáveis com o tampão de algodão e mantenha-o numa incubadora a 25 °C com 60% de humidade. Ajuste o ciclo de luz da incubadora para 12 h claro/12 h escuro.
3. Após a incubação (máximo de 8 h), classifique-os em fêmeas e machos virgens sob o microscópio e mosca, virando-os de costas e olhando para seus órgãos genitais.
   1. A genitália feminina é pálida em comparação com a genitália masculina, que são de cor avermelhada. Os machos também podem ser identificados pela presença de cerdas escuras, chamadas de pentes sexuais, em seu par de patas dianteiras. Divida as moscas em dois tubos frescos (um para machos e outro para fêmeas) e incube-as por 6-8 dias a 25 °C.
      NOTA: A 25 °C, as fêmeas permanecem virgens por aproximadamente 8 h após a eclosão.

4. Teste de depósito fecal

1. Rotule as placas de Petri com a cepa, sexo e droga correspondentes para evitar confusão entre as placas de Petri. Empilhe as placas de Petri umas sobre as outras.
2. Pegue as placas de Petri contendo o alimento tingido e reverta-as no papel mata-borrão para absorver o líquido extra. Usando uma espátula (Figura 1B), corte o alimento em 12 partes iguais e, em seguida, use a espátula para colocar uma fatia em uma placa de Petri vazia.
   NOTA: Dependendo do número de repetições, o número de fatias a serem cortadas pode ser aumentado até 20 por placa de Petri. Cada fatia deve ser do mesmo tamanho.
3. Anestesiar as moscas com CO₂ até que todas as moscas estejam dormindo no tampão de algodão. Transfira seis moscas saudáveis em cada placa de Petri (Figura 1C), feche imediatamente a tampa e coloque-as na incubadora (25°C, 60% de umidade, 12 h claro/ 12 h escuro).
4. Para garantir que as moscas não escapem da placa de Petri durante o experimento, prenda as tampas superior e inferior da placa de Petri com uma fita. Para cada grupo de teste, prepare seis placas de Petri repetidas (pelo menos).
5. Depois de permitir que as moscas criem por 24 h, use CO₂ para anestesia-las, transfira as moscas para um recipiente cheio de etanol 70% e descarte qualquer alimento restante.
6. Guarde as placas de Petri e prossiga para o passo 5.

5. Quantificação de placas de Petri

1. Defina uma pasta no computador e renomeie-a, incluindo o nome da cepa do experimento, o sexo das moscas e o tipo de drogas usadas. Dentro dessa pasta, crie subpastas denominadas Original, Recorte e Análise.
2. Digitalize as placas de Petri usando um scanner de alta resolução com uma resolução óptica de 6.400 pixels por polegada (ppi). Digitalize as tampas superior e inferior de cada placa de Petri separadamente, colocando-as individualmente no meio do campo do scanner.
3. Abra o aplicativo instalado no computador. Uma janela de boas-vindas será aberta na tela do computador com todas as configurações gerais (Figura 2A).
   Observação : não modifique as configurações avançadas. Esta etapa é válida apenas para usuários que possuem o mesmo scanner proposto na Tabela de Materiais. Consulte as diretrizes se estiver usando outro software.
   1. Nomeie a placa de Petri na aplicação, incluindo número de sequência, tampa superior ou inferior, sexo e tipo de alimento usado. Selecione a subpasta original definida na etapa 5.1.
   2. Visualize a placa de Petri. Clique em Visualizar na parte inferior da janela, aguarde alguns segundos para que o scanner faça a pré-varredura e, em seguida, uma janela aparecerá na tela do computador. Mova o quadrado exibido na tela para cercar a placa de Petri.
   3. Clique em Digitalizar no canto inferior direito da janela na tela do computador, a digitalização é salva automaticamente como uma imagem na pasta de escolha.
4. Recorte a imagem usando um aplicativo (por exemplo, o aplicativo de código aberto de Fiji), para que nenhum artefato e resíduo de alimento sejam considerados como depósitos.
   Observação : as etapas a seguir são válidas somente para usuários que têm o aplicativo Fiji. Consulte as diretrizes se estiver usando outro software.
   1. Abra o aplicativo Fiji, aguarde alguns segundos até que uma barra de ferramentas apareça na tela.
   2. Arraste a imagem a ser cortada para a barra de ferramentas. Selecione as seleções do polígono do 3º ícone na barra de ferramentas, corte a parte indesejada da foto (o gráfico de pizza colorido) clicando na tela para marcar um ângulo ao redor do gráfico de pizza (Figuras 2B-1,2).
      NOTA: Ao delinear a região de recorte dentro de uma imagem, é imperativo que os quadros escolhidos estejam perfeitamente conectados de ponta a ponta.
   3. Clique em Editar no canto superior esquerdo da barra e, em seguida, em Preencher/Limpar fora (Figura 2B-3).
   4. Para salvar a foto, clique em Arquivo no canto superior esquerdo da barra, depois em Salvar como e, finalmente, em Tiff. Escolha a subpasta Cut definida na etapa 5.1.
      Observação : ao salvar a imagem cortada, certifique-se de que nenhum caractere especial (por exemplo, !, &, $, #, _,-,...) ou muitos caracteres estão presentes no nome do arquivo .

Figura 2: Principais etapas no processo de análise dos dados do teste de depósito fecal. (A) Captura de tela mostrando as informações de configuração do aplicativo de verificação. (B) Imagens recortadas usando o aplicativo Fiji. Certifique-se de que nenhum artefato e resíduo de alimento sejam considerados depósitos. (C) Captura de tela mostrando como ele se parece ao abrir o aplicativo Excel_merge-v4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

6. Identificação de depósitos fecais usando o leitor final de esterco software de código aberto

NOTA: A introdução e o uso do leitor final de software de esterco podem ser encontrados no Arquivo Suplementar 1.

1. Primeiro, abra o software T.U.R.D. (Figura 1 Suplementar). Crie um novo experimento e dê um nome ao documento e, em seguida, salve-o na subpasta Analysis definida na etapa 5.1.
2. Clique em Placas e, em seguida, em Adicionar placa. Selecione a placa de Petri a ser processada. Uma nova janela aparece com os nomes das placas selecionadas e novos parâmetros. Defina o tamanho do bloco, o deslocamento, o tamanho mínimo e o tamanho máximo (Figura 2 suplementar).
3. Para verificar se os depósitos fecais detectados são os corretos, clique em Placas, depois em Inspecionar Placas Selecionadas, depois em Gráficos e Exibir imagens anotadas (Figura 3 Suplementar). Aumente o zoom e veja as contagens. Se houver apenas alguns depósitos que não devem ser incluídos na análise, desmarque os depósitos a serem excluídos (Figura Suplementar 4).
4. Para cada nova imagem a ser processada, reinicie a partir da etapa 6.3.
5. Após analisar as placas com o software T.U.R.D., modifique o número de moscas clicando em Não. Moscas (Figura 5 Suplementar).
6. Modifique o nome do grupo clicando em Placas > Editar grupos > Adicionar e, em seguida, na coluna Grupo , escolha o nome do grupo.
7. Exporte os diferentes dados de replicação separadamente clicando em Analisar > Estatísticas Descritivas > Selecionar Grupo (Figura 6 Suplementar). Mantenha todos os arquivos de planilha (.csv) na mesma pasta.
8. Para reunir todos os arquivos (obtidos na etapa 6.7) em uma planilha exclusiva, abra o aplicativo Excel_merge-v4 (Supplementary Coding File 1), aguarde até que a seguinte frase apareça Selecione o caminho da pasta (com .csv arquivos):, e cole o endereço da pasta acima. Por exemplo, o caminho pode ser C:\Experiment\Fecal deposit test\ e clicar em Enter duas vezes no teclado (Figura 2C). Depois disso, um novo arquivo de planilha é criado na mesma pasta. O novo arquivo de planilha inclui todos os arquivos exportados em planilhas diferentes.
9. No arquivo de planilha anterior, adicione outra planilha para coletar a média de cada parâmetro de todas as replicações (use a função PROCV para processar os dados). Um exemplo é dado na Tabela Suplementar 1.
10. Analise o valor de p.

Discussion

D. melanogaster tem sido amplamente aceita como modelo para vários processos biológicos devido à semelhança de genes entre D. melanogaster e humanos³⁶. O uso de D. melanogaster como modelo para estudar o trato intestinal é prevalente e a aplicação de T.U.R.D. tem sido utilizada para estimar o número, a área e a quantidade de depósitos fecais. Entretanto, o método de detecção fenotípica não tem sido utilizado para avaliar a diarreia em moscas-das-frutas. Portanto, este protocolo introduz um novo método para avaliar grosseiramente a presença de diarreia através da detecção dos depósitos fecais.

Os depósitos fecais são um indicador essencial da função e da saúde do trato intestinal³⁷. Neste contexto, um método é proposto para a criação de D. melanogaster em meio contendo fármaco para investigar vários parâmetros de depósitos fecais. Ao monitorar o número de depósitos, é possível determinar a frequência de defecação e avaliar se uma droga tem algum impacto no trânsito intestinal. A área total dos depósitos pode ser medida para avaliar a concentração e diluição da matéria fecal, que é um fator importante na determinação da saúde geral do trato intestinal. Além disso, a densidade óptica integrada total (DIO) pode ser usada para detectar a quantidade total de material fecal presente nos depósitos. Este protocolo fornece um método eficiente para triagem e avaliação de drogas, bem como extratos de plantas que afetam o trato intestinal. Quando D. melanogaster é utilizada como organismo modelo, é possível avaliar a eficácia de potenciais fármacos, o que pode ajudar a acelerar o processo de descoberta de fármacos. Ao aplicar este método em extratos de plantas, os pesquisadores podem ajudar a validar seu uso como agentes antidiarreicos.

Existem vários passos críticos a serem considerados ao usar este protocolo para estudar depósitos fecais em D. melanogaster. Em primeiro lugar, é essencial calcular a massa necessária para atingir a concentração desejada do fármaco no meio. Além disso, é importante garantir boas condições de preparação ao adicionar o medicamento ao meio, pois altas temperaturas podem degradar o medicamento e afetar sua potência. Em segundo lugar, a seleção de moscas fêmeas é importante neste protocolo. É importante usar moscas virgens para evitar as diferenças na produção fecal entre fêmeas virgens e acasaladas. Por exemplo, as manchas produzidas por fêmeas virgens são mais circulares do que fêmeas acasaladas, e fêmeas acasaladas tendem a excretar mais material fecal do que fêmeas virgens^27,28. Portanto, recomenda-se coletar moscas antes de 8 h de eclosão para garantir que todas as fêmeas coletadas sejam virgens. Além disso, as moscas testadas devem ser fortes e saudáveis, pois sua saúde pode influenciar a ingestão de alimentos e a produção fecal. Por exemplo, moscas com uma forma anormal de asas podem ter dificuldade em obter o alimento. Finalmente, para usar o T.U.R.D. com sucesso, o tamanho do bloco (pixels) e as configurações de deslocamento são cruciais. Devido à diferença no contraste de luz das imagens, pode ser necessário tentar diferentes ajustes para obter a melhor identificação possível dos depósitos fecais.

Embora o método apresentado seja eficaz, existem várias limitações. Uma delas é a precisão da concentração da droga no meio. Como o meio é aquecido durante a preparação, um pouco de água pode evaporar, o que pode afetar a concentração da droga. Outra limitação é a varredura das placas de Petri. Algumas partes das placas de Petri (ou seja, bordas) não são escaneadas, e isso pode resultar em um erro de cálculo dos depósitos fecais totais. Além disso, as moscas não produzem a mesma quantidade de depósitos fecais nas tampas superior e inferior das placas de Petri. Como tendem a produzir mais depósitos na tampa inferior, o desvio padrão da análise entre a tampa superior e inferior pode ser alto, o que pode afetar a precisão dos resultados.

Usando este protocolo, os pesquisadores podem estudar a diarreia em D. melanogaster. Ao modificar o meio contendo drogas, este método pode ser usado para rastrear plantas antidiarreicas, o que fornece uma nova abordagem para a descoberta de drogas. A medicina tradicional e os produtos naturais têm sido usados há séculos para tratar diferentes doenças, incluindo distúrbios gastrointestinais. Com o uso deste protocolo para avaliar a eficácia de extratos vegetais sobre depósitos fecais, novos tratamentos potenciais para doenças do trato intestinal podem ser identificados e uma justificativa científica para seu uso como agentes antidiarreicos pode ser fornecida. Essa abordagem pode fornecer uma valiosa contribuição para o campo da descoberta de drogas e etnofarmacologia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemical & Food medium
Agar	Sigma Aldrich	A7002	5 Kg bucket
Bromophenol blue	Sigma Aldrich	34725-61-6	B5525-25G
Corn flour	Nature et Cie	*910007	25 Kg bag
Crofelemer	Napo pharmaceuticals	-	-
Ethanol 96%	-	-	-
Loperamide	Sigma Aldrich	L4762	5 grams
Moldex	VWR	1.06757.5000	5 Kg bag
Propionic acid	Dutscher	409553-CER	1 Liter bottle
Sugar	Pomona EpiSaveurs	52705	1 Kg bag
Yeast	Dutscher	789195	10 Kg bag
Materials
Beaker	DWK LIFE SCIENCE	-	250 mL
Centrifugation tube	Eppendorf	30119401	Eppendorf tubes  5.0 mL
CO2 tank	-	-	-
Erlen Meyer flask	-	-	500 mL (for extraction)
Filter paper grade	Whatman	-	3 mm chr.
Flowbuddy socle	Genesis	-	-
Flugs Narrow Plastic vials	Genesis	49-102	-
Flystuff Blow gun	Genesis	-	-
Flystuff Ultimate Flypad	Genesis	-	-
Flystuff Foot pedal	Genesis	-	-
Forceps	Dumostar	11295-51	-
Graduated cylinder	-	-	100 mL
Inox spatula	-	-	-
Micropipette	Eppendorf	4924000088	Eppendorf Reference 2
Micropipette tip	Eppendorf	30000919	epT.I.P.S. Standard
Narrow Drosophila vials	Genesis	32-120	-
Paintbrush	-	-	-
Petri dish	Greiner	628162	Size: 60 x 15mm
Round-bottom flask	-	-	500 mL (for evaporation)
Thermometer	Avantor	620-0916
Whisk	-	-	-
Equipments
Chiller	HUBER	Minichiller	-
Heating bath	BÜCHI	B-490	-
Heating plate	BIOBLOCK SCIENTIFIC	-	Magnetic stirrer hot plate
Incubator	Memmert	-	HPP110eco
Rotary evaporator	BÜCHI	R-200	-
Scanner	Epson	V850 pro	-
Shaker	Edmund Bühle	KS 10	-
Stereomicroscope binocular	Zeiss	Stemi 305	-
Vacuum pump	VACUUBRAND	PC500 series	-
Vortex mixer	Sigma Aldrich	CLS6776-1EA	Corning LSE vortex mixers
Weighing scale	OHAUS Scout	SKX622	-