Высокопроизводительная экспрессия и очистка носителей растворенных веществ человека для структурных и биохимических исследований

Summary

Структурные и биохимические исследования мембранных транспортеров человека требуют миллиграммовых количеств стабильного, интактного и однородного белка. В этой статье мы опишем масштабируемые методы скрининга, экспрессии и очистки переносчиков растворенных веществ человека с использованием генов, оптимизированных для кодонов.

Abstract

Носители растворенных веществ (SLC) — это мембранные транспортеры, которые импортируют и экспортируют ряд эндогенных и экзогенных субстратов, включая ионы, питательные вещества, метаболиты, нейротрансмиттеры и фармацевтические препараты. Несмотря на то, что они стали привлекательными терапевтическими мишенями и маркерами заболеваний, эта группа белков все еще относительно недооценена современными фармацевтическими препаратами. Проекты по разработке лекарств для этих переносчиков затруднены из-за ограниченных структурных, функциональных и физиологических знаний, в конечном счете, из-за трудностей в экспрессии и очистке этого класса белков, встроенных в мембраны. В этой статье мы демонстрируем методы получения высокочистых, миллиграммовых количеств белков-переносчиков SLC человека с использованием кодон-оптимизированных последовательностей генов. В сочетании с систематическим изучением конструкционного дизайна и высокопроизводительной экспрессии, эти протоколы обеспечивают сохранение структурной целостности и биохимической активности белков-мишеней. Мы также выделяем важнейшие этапы экспрессии эукариотических клеток, аффинной очистки и хроматографии с исключением размера этих белков. В конечном счете, этот рабочий процесс позволяет получить чистые, функционально активные и стабильные белковые препараты, пригодные для определения структуры с высоким разрешением, исследований переноса, анализа вовлечения малых молекул и высокопроизводительного скрининга in vitro .

Introduction

Мембранные белки уже давно являются мишенью как для исследователей, так и для фармацевтической промышленности. Из них растворенные носители (SLC) представляют собой семейство из более чем 400 вторичных генов-переносчиков, закодированных в геноме человека¹. Эти переносчики участвуют в импорте и экспорте многочисленных молекул, включая ионы², нейротрансмиттеры³, липиды 4,5,6,7, аминокислоты⁸, питательные вещества 9,10,11 и фармацевтические препар....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все кодон-оптимизированные гены RESOLUTE SLC были депонированы в AddGene⁴³, ссылки на который доступны в списке общедоступных реагентов RESOLUTE⁴⁴. Эти гены были клонированы в плазмиду pDONR221 и позволяют напрямую клонировать гены в целевой вектор с помощью рекомби.......

Discussion

Разработка SLC-таргетной терапии по-прежнему затруднена из-за отсутствия систематической характеристики функции транспортера. Это привело к непропорционально меньшему количеству препаратов, нацеленных на этот класс белков по сравнению с GPCR и ионными каналами⁶³, несмотря н.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3C protease	Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators	Sartorius	VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside	Anatrace	C325	CYMAL-5
96-well bacmid purification kit	Millipore	LSKP09604	Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL)	Greiner Bio-One	780271
Adhesive plastic seals	Qiagen	19570	Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse	Produced in-house
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt	Anatrace	CH210	CHS
Cobalt metal affinity resin	Takara Bio	635653	TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin	Sigma Aldrich	851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin	Apollo Scientific	BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL)	DWK Life Sciences	357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher	10500064
Fos-Choline-12	Anatrace	F308S	FS-12
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516
Glyco-diosgenin	Anatrace	GDN101	GDN
Gravity flow columns	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 medium	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 medium
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole	Sigma Aldrich	56750
Insect transfection reagent	Sigma Aldrich	71259	Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG310	LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate	Sigma Aldrich	M2670
Micro-expression shaker	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside	Anatrace	D322	DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside	Anatrace	D310	DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide	Anatrace	D360	LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	N324S	NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside	Anatrace	O311D	OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl Ether	Anatrace	O330	C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol	Anatrace	NG311	OGNG
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether	Anatrace	AP1210	C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether	Anatrace	APO129	C12E9
Porous seal for tissue culture plates	VWR	60941-084	Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
Recombination enzyme mix	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media	Gibco	10902088	Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	303410
Sonicator 24-head probe	Sonics	630-0579
Sonicator power unit	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin resin	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903
Sucrose Monododecanoate	Anatrace	S350	DDS
Suspension-adapted HEK293 cells	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
Transfection reagent	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice Transfection Reagent