Isolamento di cellule con informazioni morfologiche e spaziali da campioni di fibrosi sottomucosa orale mediante microdissezione a cattura laser

Riepilogo

La microdissezione a cattura laser dei tessuti di fibrosi sottomucosa orale consente l'estrazione precisa di cellule dalle regioni istologiche di interesse per l'analisi di dati multi-omici con informazioni morfologiche e spaziali.

Abstract

La fibrosi sottomucosa orale (OSF) è un tipo comune di disturbo potenzialmente maligno nella cavità orale. L'atrofia dell'epitelio e la fibrosi della lamina propria e della sottomucosa si riscontrano spesso sui vetrini istopatologici. È stato proposto che la displasia epiteliale, l'atrofia epiteliale e i fibroblasti senescenti siano associati alla trasformazione maligna della OSF. Tuttavia, a causa dell'eterogeneità delle malattie orali potenzialmente maligne e del carcinoma orale a cellule squamose, è difficile identificare i meccanismi molecolari specifici della trasformazione maligna nella OSF. Qui, presentiamo un metodo per ottenere un piccolo numero di cellule epiteliali o mesenchimali che trasportano dati morfologici e informazioni spaziali mediante microdissezione a cattura laser su vetrini di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina. Utilizzando un microscopio, possiamo catturare con precisione il tessuto epiteliale displastico o atrofico su microscala (~500 cellule) e il tessuto subepiteliale fibrotico. Le cellule estratte possono essere valutate mediante sequenziamento del genoma o del trascrittoma per acquisire dati genomici e trascrittomici con informazioni morfologiche e spaziali. Questo approccio rimuove l'eterogeneità del sequenziamento di tessuti OSF e l'interferenza causata dalle cellule in aree non lesionate, consentendo un'analisi spazio-omica precisa del tessuto OSF.

Introduzione

La fibrosi sottomucosa orale (OSF) è una malattia cronica e insidiosa che si sviluppa principalmente nella mucosa vestibolare e provoca una limitazione dell'apertura della bocca¹. Mentre l'OSF è una malattia multifattoriale, la masticazione della noce di areca o della noce di betel è la causa principale dell'OSF ^2,3. A causa di questa abitudine geograficamente specifica, l'OSF è prevalentemente concentrata nelle popolazioni del sud-est e del sud dell'Asia³. Le caratteristiche istologiche comuni dell'OSF includono la deposizione anomala di collagene nel tessuto co

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della Scuola e dell'Ospedale dell'Università di Pechino. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti. I campioni di tessuto utilizzati in questo studio sono stati resi anonimi. Lo schema di studio è illustrato nella Figura 1.

1. Preparazione del campione

1. Tagliare i tessuti di fibrosi sottomucosa orale fissati in formalina e inclusi in paraffina in sezioni continue di 3 μm e 10 μm di spessore su un microtomo.
2. Aprire le sezioni in acqua e poi pescare sugli scivoli. Fissare le sezioni da 3 μM e 10 μ

Risultati

Eseguendo la microdissezione laser dei tessuti OSF, abbiamo catturato campioni di epitelio displastico, stroma sotto l'epitelio displastico, epitelio atrofico e stroma sotto il tessuto epiteliale atrofico (Figura 1). Attraverso l'estrazione del DNA e il sequenziamento dell'intero genoma a bassa profondità, siamo stati in grado di analizzare le alterazioni del numero di copie (CNA) correlate alla morfologia15. La CNA è una forma comune di instabilità genomica associ...

Discussione

Questo protocollo ha riportato una pipeline per catturare campioni di tessuto OSF con informazioni morfologiche e spaziali per ulteriori analisi spazio-omiche attraverso la microdissezione laser. Dai risultati rappresentativi, abbiamo identificato diversi modelli CNA tra vari campioni correlati alla morfologia.

L'OSF, un tipo di OPMD, è una condizione precancerosa comune del carcinoma orale a cellule squamose⁶. È stato riportato che l'instabilità genomica è associat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion microscope slides	CITOTEST	REF.188105
Div-haematoxylin	YiLi	20230326
Eosin solution	BASO	BA4098
Ethanol	PEKING REAGENT	No.32061
Harris hematoxylin dye solution	YiLi	20230326
Hot plate	LEICA	HI1220
Laser capture microdissection system	LEICA	LMD7	Machine
Laser microdissection microsystem	LEICA	8.2.3.7603	Software
Micromount mounting medium	LEICA	REF.3801731
Microscope cover glass	CITOTEST	REF.10212450C
Microtome	LEICA	RM2235
PCR tubes	AXYGEN	16421959
PEN-membrane slides	LEICA	No.11505158
Re-blue solution	YiLi	20230326
Ultrapure distilled water	Invitrogen	REF.10977-015
Xylene	PEKING REAGENT	No.33535