בהדמיה של פעילות ספונטנית בקליפת המוח החושית של עכבר יילודים ברזולוציה של נוירון יחיד

Summary

אזורים חושיים ראשוניים בניאוקורטקס מפגינים פעילויות ספונטניות ייחודיות במהלך ההתפתחות. מאמר זה מתאר כיצד לדמיין פעילויות נוירונים בודדות ואזורי חישה ראשוניים כדי לנתח פעילויות סינכרוניות ספציפיות לאזור בעכברים ילודים in vivo.

Abstract

מוח היונקים עובר שינויים התפתחותיים דינמיים הן ברמה התאית והן ברמה המעגלית במהלך התקופה שלפני הלידה ואחריה. בעקבות גילויים של גנים רבים התורמים לשינויים התפתחותיים אלה, ידוע כיום כי גם הפעילות העצבית מווסתת תהליכים אלה באופן משמעותי. בקליפת המוח המתפתחת, תאי עצב מפגינים דפוסי פעילות מסונכרנים המתמחים בכל אזור חושי ראשוני. דפוסים אלה שונים במידה ניכרת מאלה שנצפו בקליפת המוח הבוגרת, ומדגישים את תפקידם בוויסות תהליכים התפתחותיים ספציפיים לאזור. ליקויים בפעילות העצבית במהלך ההתפתחות עלולים להוביל למחלות מוח שונות. ממצאים אלה מדגישים את הצורך לבחון את מנגנוני הבקרה העומדים בבסיס דפוסי הפעילות בהתפתחות העצבית. מאמר זה מסכם סדרה של פרוטוקולים כדי להמחיש אזורים חושיים ראשוניים ופעילות עצבית בעכברים ילודים, כדי לדמות את הפעילות של נוירונים בודדים בתוך תת-שדות קליפת המוח באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים in vivo, ולנתח מתאמי פעילות הקשורים לתת-שדה. אנו מראים תוצאות מייצגות של פעילות סינכרונית דמוית טלאים בתוך חביות בודדות בקליפת המוח הסומטוסנסורית. אנו דנים גם ביישומים פוטנציאליים שונים ובכמה מגבלות של פרוטוקול זה.

Introduction

קליפת המוח מכילה מספר אזורים חושיים בעלי תפקודים מובחנים. האזורים מקבלים קלט שמקורו באיברי החישה המתאימים להם, המועברים בעיקר דרך חוט השדרה או גזע המוח ומועברים דרך התלמוס ^1,2. יש לציין כי תאי עצב בכל אזור חושי ראשוני מפגינים פעילות מסונכרנת ייחודית בשלבים התפתחותיים מוקדמים, שמקורה גם באיברי החישה או במרכזי העצבים התחתונים, אך שונה במהותה מהפעילויות שנצפו בקליפת המוח הבוגרת³.

במכרסמים בילודים, למשל, אזור הראייה הראשוני (V1) מציג פעילות דמוית גל, שמקורה ברשתית (גל רשתית) ומתפשט לאורך כל מסלול הראייה תוך שימור רטינוטופיה

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קומאמוטו והמכון הלאומי לגנטיקה ואושרו על ידי ועדות הניסויים בבעלי חיים.

1. אלקטרופורציה ברחם (IUE)

1. זיווג עכברי TCA-RFP זכרים מרקע ICR עם נקבות עכברי ICR מסוג בר. התבונן בפקק הנרת?.......

Discussion

בהתחשב בכך שהפעילויות הספונטניות יוצאות מאיבר החישה או ממערכת העצבים התחתונה ונודדות לאזור החישה הראשוני דרך מסלול שווה ערך לזה של מערכת עצבים בוגרת³, חיוני להגדיר את האזור החישה הראשוני ואת מיקומם של תאי עצב מצולמים בתוך האזור. בפרוטוקול זה, התייחסנו לדרי?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System	Corning	431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA)	Nacalai	09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II)	GC	N/A
Agarose	Sigma	A9793
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
Electroporator	BEX	GEB14
Eye drop (Scopisol)	Senju Pharmaceutical	N/A
Fluorescence stereo microscope	Leica	M165FC
Glucose	Nacalai	16806-25
Heating pad	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
Isoflurane	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
Micropipette puller	Narishige	PC-100
Multiphoton laser	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe)	Kimberly Clark	S-200
Phosphate buffered saline (PBS)	Nacalai	27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
Plasmid: TRE-nCre	Addgene	pK031
Precision calibrated micropipets	Drummond	2-000-050
Razor blade	Feather	FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)	Zoetis JP	N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter	Matsunami	CS01078
Saline	Otsuka	035175315
Sodium pentobarbital	Nacalai	26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning)	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Titanium bar	Endo Scientific Instrument	N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate		N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue	Sigma	T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter	BEX	CUY650P5
Wild-type ICR mouse	Nihon SLC	Slc:ICR