Visualizzazione in vivo dell'attività spontanea nella corteccia sensoriale del topo neonatale con risoluzione di un singolo neurone

Summary

Le aree sensoriali primarie nella neocorteccia mostrano attività spontanee uniche durante lo sviluppo. Questo articolo descrive come visualizzare le attività dei singoli neuroni e le aree sensoriali primarie per analizzare le attività sincrone area-specifiche nei topi neonatali in vivo.

Abstract

Il cervello dei mammiferi subisce cambiamenti dinamici dello sviluppo sia a livello cellulare che circuitale durante i periodi prenatale e postnatale. A seguito della scoperta di numerosi geni che contribuiscono a questi cambiamenti dello sviluppo, è ora noto che anche l'attività neuronale modula sostanzialmente questi processi. Nella corteccia cerebrale in via di sviluppo, i neuroni mostrano modelli di attività sincronizzati che sono specializzati per ciascuna area sensoriale primaria. Questi modelli differiscono notevolmente da quelli osservati nella corteccia matura, sottolineando il loro ruolo nella regolazione dei processi di sviluppo area-specifici. Le carenze nell'attività neuronale durante lo sviluppo possono portare a varie malattie cerebrali. Questi risultati evidenziano la necessità di esaminare i meccanismi regolatori alla base dei modelli di attività nello sviluppo neuronale. Questo articolo riassume una serie di protocolli per visualizzare le aree sensoriali primarie e l'attività neuronale nei topi neonati, per visualizzare l'attività dei singoli neuroni all'interno dei sottocampi corticali utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo e per analizzare le correlazioni dell'attività correlata al sottocampo. Mostriamo risultati rappresentativi di un'attività sincrona simile a un patchwork all'interno di singoli barili nella corteccia somatosensoriale. Discutiamo anche varie potenziali applicazioni e alcune limitazioni di questo protocollo.

Introduction

La corteccia cerebrale contiene diverse aree sensoriali con funzioni distinte. Le aree ricevono input provenienti dai loro organi sensoriali corrispondenti, per lo più convogliati attraverso il midollo spinale o il tronco encefalico e trasmessi attraverso il talamo ^1,2. In particolare, i neuroni in ciascuna area sensoriale primaria mostrano un'attività sincronizzata in modo univoco durante le prime fasi di sviluppo, che originano anche dagli organi sensoriali o dai centri nervosi inferiori, ma differiscono essenzialmente dalle attività osservate nella corteccia matura

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida per la sperimentazione animale dell'Università di Kumamoto e dell'Istituto Nazionale di Genetica e approvati dai comitati per la sperimentazione animale.

1. Elettroporazione in utero (IUE)

1. Accoppiare topi maschi TCA-RFP di background ICR con topi ICR femmina wild-type. Osservare il tappo vaginale per verificare l'accoppiamento la mattina presto del .......

Discussion

Dato che le attività spontanee emergono dall'organo sensoriale o sistema nervoso inferiore e viaggiano verso l'area sensoriale primaria attraverso un percorso equivalente a quello di un sistema nervoso maturo³, è fondamentale definire l'area sensoriale primaria e la posizione dei neuroni ripresi all'interno dell'area. In questo protocollo, abbiamo affrontato questo requisito impiegando topi transgenici che visualizzano gli assoni talamocorticali e il sistema Sup.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System	Corning	431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA)	Nacalai	09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II)	GC	N/A
Agarose	Sigma	A9793
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
Electroporator	BEX	GEB14
Eye drop (Scopisol)	Senju Pharmaceutical	N/A
Fluorescence stereo microscope	Leica	M165FC
Glucose	Nacalai	16806-25
Heating pad	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
Isoflurane	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
Micropipette puller	Narishige	PC-100
Multiphoton laser	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe)	Kimberly Clark	S-200
Phosphate buffered saline (PBS)	Nacalai	27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
Plasmid: TRE-nCre	Addgene	pK031
Precision calibrated micropipets	Drummond	2-000-050
Razor blade	Feather	FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)	Zoetis JP	N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter	Matsunami	CS01078
Saline	Otsuka	035175315
Sodium pentobarbital	Nacalai	26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning)	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Titanium bar	Endo Scientific Instrument	N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate		N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue	Sigma	T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter	BEX	CUY650P5
Wild-type ICR mouse	Nihon SLC	Slc:ICR