Визуализация in vivo спонтанной активности в сенсорной коре новорожденных мышей с разрешением одного нейрона

Summary

Первичные сенсорные области в неокортексе демонстрируют уникальную спонтанную активность во время развития. В этой статье описывается, как визуализировать активность отдельных нейронов и первичных сенсорных областей для анализа синхронной активности, специфичной для конкретных областей, у неонатальных мышей in vivo.

Abstract

Мозг млекопитающих претерпевает динамические изменения в развитии как на клеточном, так и на сетевом уровнях на протяжении пренатального и постнатального периодов. После открытия многочисленных генов, способствующих этим изменениям в развитии, теперь известно, что нейронная активность также существенно модулирует эти процессы. В развивающейся коре головного мозга нейроны демонстрируют синхронизированные паттерны активности, которые специализированы для каждой первичной сенсорной области. Эти паттерны заметно отличаются от тех, которые наблюдаются в зрелой коре, подчеркивая их роль в регуляции процессов развития, специфичных для данной области. Дефицит нейронной активности во время развития может привести к различным заболеваниям головного мозга. Эти результаты подчеркивают необходимость изучения регуляторных механизмов, лежащих в основе паттернов активности в развитии нейронов. В этой статье обобщен ряд протоколов для визуализации первичных сенсорных областей и нейронной активности у неонатальных мышей, для визуализации активности отдельных нейронов в корковых подполях с помощью двухфотонной микроскопии in vivo, а также для анализа корреляций активности, связанных с подполем. Мы демонстрируем репрезентативные результаты лоскутной синхронной активности в отдельных бочках соматосенсорной коры. Мы также обсудим различные потенциальные применения и некоторые ограничения этого протокола.

Introduction

Кора головного мозга содержит несколько сенсорных областей с различными функциями. Эти области получают входные сигналы, поступающие от соответствующих органов чувств, в основном передаваемые через спинной мозг или ствол головного мозга и ретранслируемые через таламус ^1,2. Примечательно, что нейроны в каждой первичной сенсорной области демонстрируют уникально синхронизированную активность на ранних стадиях развития, которая также исходит от органов чувств или нижних нервных центров, но существенно отличается от активности, наблюдаемой в зрелой коре головного^м....

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами экспериментов на животных Университета Кумамото и Национального института генетики и были одобрены комитетами по экспериментам на животных.

1. Внутриутробная электропора?.......

Discussion

Учитывая, что спонтанные действия исходят из органа чувств или низшей нервной системы и перемещаются в первичную сенсорную область по^пути, эквивалентному пути зрелой нервной системы, крайне важно определить первичную сенсорную область и расположение в?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System	Corning	431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA)	Nacalai	09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II)	GC	N/A
Agarose	Sigma	A9793
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
Electroporator	BEX	GEB14
Eye drop (Scopisol)	Senju Pharmaceutical	N/A
Fluorescence stereo microscope	Leica	M165FC
Glucose	Nacalai	16806-25
Heating pad	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
Isoflurane	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
Micropipette puller	Narishige	PC-100
Multiphoton laser	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe)	Kimberly Clark	S-200
Phosphate buffered saline (PBS)	Nacalai	27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
Plasmid: TRE-nCre	Addgene	pK031
Precision calibrated micropipets	Drummond	2-000-050
Razor blade	Feather	FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)	Zoetis JP	N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter	Matsunami	CS01078
Saline	Otsuka	035175315
Sodium pentobarbital	Nacalai	26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning)	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Titanium bar	Endo Scientific Instrument	N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate		N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue	Sigma	T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter	BEX	CUY650P5
Wild-type ICR mouse	Nihon SLC	Slc:ICR