Энтероиды становятся новой моделью для изучения физиологии и патофизиологии тканей, разработки лекарств и регенеративной медицины. Здесь мы описываем 2D-систему культивирования первичных клеток крупного рогатого скота, полученную из энтероидов, которая позволяет проводить совместное культивирование с соответствующими типами клеток тканей. Эта модель предлагает трансляционное преимущество для моделирования исследований желудочно-кишечного тракта.
Системы культивирования органоидных клеток могут повторить сложность, наблюдаемую в тканях, что делает их полезными при изучении взаимодействий патогена и хозяина, оценке эффективности и токсичности лекарств, а также в биоинженерии тканей. Однако применение этих моделей по описанным причинам может быть ограничено из-за трехмерной (3D) природы этих моделей. Например, использование 3D-систем энтероидных культур для изучения заболеваний органов пищеварения является сложной задачей из-за недоступности просвета кишечника и секретируемых им веществ. Действительно, стимуляция 3D-органоидов патогенами требует либо просветной микроинъекции, либо механического разрушения трехмерной структуры, либо генерации апикальных энтероидов. Более того, эти органоиды не могут культивироваться совместно с иммунными и стромальными клетками, что ограничивает углубленный механистический анализ патофизиологической динамикой. Чтобы обойти эту проблему, мы оптимизировали двухмерную (2D) однослойную систему культивирования первичных клеток крупного рогатого скота, полученную из энтероидов, что позволило проводить совместное культивирование с другими соответствующими типами клеток. Подвздошные крипты, выделенные из здорового взрослого крупного рогатого скота, культивировались для получения 3D-органоидов, которые были криоконсервированы для будущего использования. Двухмерный монослой был создан с использованием реанимированных 3D-энтероидов, которые пассировались и разрушались с получением одиночных клеток, которые были высеяны на покрытые базальной мембраной трансвелл-клеточные вставки, покрытые экстрактом, тем самым обнажая их апикальную поверхность. Полярность монослоя кишечника, клеточная дифференцировка и барьерная функция были охарактеризованы с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и измерения трансэпителиального электрического сопротивления. Стимуляция апикальной поверхности монослоя выявила ожидаемую функциональность монослоя, о чем свидетельствует секреция цитокинов как из апикальных, так и из базальных компартментов. Описанная 2D-модель монослоя, полученная из энтероидов, имеет большие перспективы в исследовании взаимодействий между хозяином и патогеном, физиологии кишечника, разработке лекарств и регенеративной медицины.
Животные модели в исследованиях играют решающую роль в углублении нашего понимания патофизиологии заболевания и динамики иммунного ответа хозяина во время инфекции и поддерживают разработку новых профилактических и терапевтических стратегий 1,2,3,4. Эти модели поддерживают научные открытия и прогресс в области животных и являются ключом к прогрессу исследований в области здоровья человека. На протяжении десятилетий модели грызунов лежали в основе достижений в области иммунных механизмов и фундаментальных биологических исследований болезней человека 3,5,6,7. В то время как модели грызунов имеют решающее значение для скрининга и исследований на ранних стадиях развития, модели крупных животных предлагают более уместное сравнение при изучении болезней человека как на ранних стадиях, так и в более поздних исследованиях развития, включая тестирование терапевтической эффективности и безопасности 1,3,4,5. Животноводство имеет явные преимущества по сравнению с моделями грызунов для более эффективной трансляции для применения человеком при некоторых заболеваниях, включая криптоспоридиоз, сальмонеллез, туберкулез, респираторно-синцитиальный вирус и бруцеллез 1,7,8. Действительно, эти и другие заболевания спонтанно развиваются у крупного рогатого скота, который имеет несколько схожих патогенеза и иммунных процессов с людьми, и, как беспородная популяция, крупный рогатый скот имитирует генетическую и экологическую гетерогенность, влияющую на иммунные реакции человека 5,8,9,10 . Преимущества моделей крупного рогатого скота для исследования инфекционных заболеваний могут быть максимизированы, если сначала использовать сложную систему культивирования, а затем поэтапно внедрять исследования in vivo. Первоначальное использование очень сложной системы культивирования крупного рогатого скота может значительно сократить количество исследований на живых животных, одновременно повышая шансы на успешные трансляционные и прикладные исследования. Культуральные модели должны повторять процессы заболевания на уровне органов для оптимальной прогностической валидности, сохраняя нативное тканевое микроокружение пространственно и функционально.
Иммунный ответ слизистой оболочки представляет собой многогранную систему, состоящую из высокоэффективного барьера, образованного энтероцитами желудочно-кишечного тракта, и разнообразными популяциями иммунных клеток, расположенных под поверхностью слизистой оболочки11. Эта очень сложная система имеет решающее значение во время инфекции для поддержания гомеостаза желудочно-кишечного тракта и инициирования иммунной защиты против кишечных патогенов11. Связь между энтероцитами и нижележащими клетками врожденного иммунитета инициирует развитие защитных иммунных реакций против патогенных микроорганизмов. Таким образом, системы культивирования, которые являются сравнительными по своему уровню сложности, необходимы для оптимального исследования взаимодействий патогенов между хозяином и кишечными патогенами и очень эффективны в понимании физиологии кишечника, а также в открытии и разработке лекарств12,13. Органоиды представляют собой устойчивую культуральную систему, которая напоминает архитектуру и функции исходной ткани14,15. Многоклеточность этих моделей позволяет исследовать роль различных клеточных популяций и клеточных взаимодействий, участвующих в здоровье и заболеваниях кишечника12,14. Тем не менее, модели органоидов человеческого происхождения в исследованиях в настоящее время ограничены сложностью получения достаточного количества и стабильного качества эпителиальных клеток кишечника человека и ограниченной жизнеспособностью клеток в культуре. Иммортализированные клеточные линии могут быть использованы для получения высоких выходов гомологичных культур в этих моделях последовательно; Однако трансформированные клетки по своей природе лишены разнообразия и функциональной сложности нетрансформированных эпителиальных клеток16,17. Преимущества использования культур, полученных из бычьей ткани, в качестве модели для исследования заболеваний и физиологии желудочно-кишечного тракта включают легкость, с которой образцы тканей могут быть последовательно получены от здоровых доноров, улучшенную жизнеспособность клеток и большее клеточное разнообразие, достижимое только с неиммортализированной тканью. Сравнительная транскриптомика тканей и характеристика кишечных органоидов выявили сходство консервативных ортологичных генов и клеточных потенциалов между человеком и крупным рогатым скотом18. Таким образом, система культивирования бычьих органоидов может быть полезна при исследовании кишечных заболеваний человека, с результатами, которые могут быть легко перенесены на медицину человека.
Протокол, описанный в настоящем документе, детализирует эффективную платформу для оценки реакции организма на кишечные патогены или соединения и физиологии кишечника с использованием 2D-системы первичной клеточной культуры бычьего энтероида. В отличие от 3D-органоидов, 2D-системы культивирования, генерируемые на трансвелл-вставках, позволяют проводить двойную культуру кишечных клеток с иммунными или стромальными клетками, что позволяет изучать динамику на тканевом уровне. Эта физиологически значимая модель, применяемая в биомедицинских исследованиях, фармацевтических разработках и испытаниях эффективности, может принести пользу здоровью и развитию как крупного рогатого скота, так и людей.
Все протоколы были выполнены в соответствии с институциональными и национальными руководящими принципами и правилами по благополучию животных.
1. Приготовление реагента
ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы и конечные концентрации реагентов, использованных в данном исследовании, приведены в таблице 1.
2. Выделение кишечных крипт из цельной ткани (рисунок 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Энтероиды тонкого кишечника крупного рогатого скота были получены из подвздошной ткани, полученной от здоровых взрослых бычков голштинской породы (>2 года) с местного завода по переработке говядины. Для этой серии экспериментов был использован один донор.
3. Генерация ex vivo и пассаж бычьих подвздошных энтероидов (рис. 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Крипты из конических пробирок с наиболее чистыми, неповрежденными кишечными криптами будут использоваться для последующих анализов. Для всех этапов, связанных с криптами и энтероидами, наконечники пипеток, скребки для клеток и пробирки должны быть предварительно покрыты буфером для покрытия, и следует избегать пузырьков, чтобы предотвратить потерю крипт. Если не указано иное, следует использовать наконечник для пипетки объемом 1000 мкл, чтобы предотвратить разрушение фрагментов крипты.
4. Генерация и оценка 2D монослоев из 3D энтероидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Как и выше, на всех этапах, связанных с криптами и энтероидами, наконечники пипеток, скребки для клеток и пробирки должны быть предварительно покрыты буфером для покрытия, и следует избегать пузырьков, чтобы предотвратить потерю крипт.
Первым шагом в создании 2D-монослоев, полученных из энтероидов, является подготовка участка ткани кишечника (рис. 1А) к диссоциации тканей. Это делается путем удаления прикрепленного жира и брыжейки из ткани (рис. 1B) с последующим разрезанием ткани в продольном направлении, чтобы обнажить поверхность просвета, чтобы слой слизи кишечника можно было удалить путем осторожного соскабливания с помощью предметного стекла. Затем собранный срез кишечника разрезают на постепенно более мелкие участки ткани (рис. 1C), чтобы облегчить диссоциацию. Затем крипты диссоциируют от подлежащей подслизистой ткани с помощью серии промывок, состоящих из хелатных буферов (рис. 1D, E) и PBS. Изолированные кишечные крипты (рис. 1F) затем встраивают в матричные купола базальной мембраны (рис. 2A) и культивируют в течение нескольких дней для получения 3D-энтероидов. Из 10-дюймового участка подвздошной кишки крупного рогатого скота можно выделить около 900 000 крипт и использовать их для формирования энтероидов. Уже через несколько часов в культуре покрытые пластинами крипты начинают удлиняться и превращаться в энтеросферы (рис. 2B). Через 2 дня можно наблюдать четко выраженный просвет (рис. 2C), а почкование структур отмечается уже на 4-й день в культуре (рис. 2D). К 7-му дню развиваются зрелые энтероиды (рис. 2E). Иммунофлуоресцентное окрашивание 7-дневного 3D-энтероида демонстрирует наличие различных клеточных линий. Конфокальная микроскопия энтероидов демонстрирует локализацию ядерного окрашивания DAPI, белка Е-кадгерина в адгезивном соединении, окрашивание хромогранином-А (Chr-A) с присутствием энтероэндокринных клеток, лизоцима (LYZ), демонстрирующего клетки Панета, и цитокератина-18 (CK-18), представляющего клетки энтероцитов на рисунке 3. После 7-10 дней в культуре энтероиды следует пассировать, чтобы обеспечить дальнейшее расширение и предотвратить скученность. Было определено, что оптимальное время пассажа энтероидов составляет 7-10 дней после первичной изоляции крипты и в конечном итоге зависит от здоровья и скорости роста энтероидов в культуре. Оптимальная плотность посева для достижения желаемой морфологии и жизнеспособности энтероидов, как показано на рисунке 2E, составляет 400 крипт на купол. Энтероиды легко поддаются криоконсервации, а размороженные фрагменты энтероидов полностью восстанавливаются для экспериментального использования после двух пассажей после оттаивания. Примечательно, что перед криоконсервацией рекомендуется, по крайней мере, два пассажа первичной культуры крипты.
Для получения монослоя, полученного из 2D-энтероидов, 3D-энтероиды собирают и в течение ряда этапов механически растирают в присутствии раствора диссоциации (рис. 4A) на отдельные клетки. Затем эти одиночные клетки могут быть высеяны на трансвелл-вкладыш, предварительно покрытый раствором матриксной питательной среды базальной мембраны. В среднем, четыре трансвелла могут быть засеяны из четырех 3D-куполов энтероида. Таким образом, количество обработанных 3D-энтероидов зависит от количества трансвеллов, необходимых для эксперимента. Покрытие одиночных клеток при плотности посева 1 x 10,5 и их первоначальное культивирование в присутствии 20% FBS (рис. 4B-D) позволяет создать сливающийся монослой менее чем за 1 неделю. Прогрессирующее слияние 2D-монослоя в культуре можно отслеживать с течением времени с помощью световой микроскопии (рис. 4E, F). Измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) могут подтвердить слияние и охарактеризовать целостность эпителиального барьера с течением времени и в ответ на экспериментальную стимуляцию (рис. 5A). В среднем, после семи дней культивирования примерно 100% сливающийся монослой будет иметь соответствующее значение TEER ~1500 Ω·см2. Лонгитюдная оценка значений TEER 2D энтероидного монослоя демонстрирует устойчивый рост значений TEER в течение семи дней, достигая максимального среднего значения 1546 Ω·см2, а затем снижаясь с самым низким значением 11,5 Ω·см2, полученным на двенадцатый день (рис. 5B). Иммунофлуоресцентное мечение дифференцированных монослоев свидетельствует о том, что по этому протоколу формируются интактные, организованные, поляризованные эпителиальные листы кишечника (рис. 6). Конфокальная микроскопия окрашенного 2D-монослоя демонстрирует локализацию окраски ядерным DAPI, E-кадгерином и F-актином (рис. 6A-D). Флуоресцентная микроскопия 2D-монослоя показывает признаки дифференцированных клеток кишечного эпителия с окрашиванием хромогранином-А (Chr-A), демонстрирующим наличие энтероэндокринных клеток, лизоцимом (LYZ), демонстрирующим клетки Панета, и цитокератином-18 (CK-18), указывающим на клеточные линии энтероцитов (рис. 6E-L). Моделирование Z-стека показывает ожидаемую поляризацию 2D монослойной культуры с характерным отложением F-актина, который обнаруживается в микроворсинках, покрывающих апикальную сторону дифференцированных энтероцитов, и Е-кадгерина, белка, расположенного в адгезивных соединениях, расположенных между эпителиальными клетками (рис. 6M).
Функциональность монослоя может быть оценена путем апикальной стимуляции различными компонентами, включая лиганды Toll-подобных рецепторов (TLR) или патогены, с последующим количественным определением цитокинов надосадочных продуктов клеточных культур, полученных из апикальных и базальных компартментов. Действительно, при стимуляции апикального аспекта монослоя в течение 24 ч агонистом TLR 1/2 Pam3csk4 на 4-й день культивирования наблюдается повышенная продукция цитокинов в обоих компартментах по сравнению с необработанными монослоями (рис. 7A, B).
Рисунок 1: Выделение крипты кишечника крупного рогатого скота от здорового взрослого крупного рогатого скота. Изображения, иллюстрирующие обработку тканей (A) цельной подвзрослой подвздошной кишки крупного рогатого скота, (B) обезжиренной подвздошной кишки, (C) подвздошной кишки, разрезанной на кусочки размером 2,5 дюйма (6,3 см) в PBS на льду, (D) срезов подвздошной ткани в диссоциационном буфере #1 при 4 °C, и (E) в диссоциационном буфере 2 во встряхивающей водяной бане при 37 °C, и (F) изолированных фрагментов подвздошной крипты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Развитие первичного 3D подвздошного энтероида крупного рогатого скота в матрице базальной мембраны. Репрезентативные изображения (A) 3D-купола энтероида, созданного в 6-луночном планшете для культивирования тканей, и (B-E) 3D-развития энтероидов на 0, 2, 4 и 7-й дни культивирования. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Трехмерные кишечные энтероиды показывают окрашивание эпителиальных клеток. Репрезентативные изображения 3D-энтероидов через 7 дней в культуре демонстрируют наличие ядерного окрашивания, F-актина, цитокератина-18 (CK-18), хромогранина-А (Chr-A), экадгерина (E-cad), лизоцима (Lyz) и наложения изображений (Merge). Масштабная линейка 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Создание 2D монослоя, полученного из энтероидов подвздошной кишки. Репрезентативные изображения (A) 3D-фрагментов энтероидов в диссоциационном растворе при подготовке к монослойному посеву, одиночных клеток, нанесенных на транслунжерную вставку с плотностью затравки 1 x 10,5, полученные на 0-й день с использованием (B) света, (C) фазового контраста и (D) яркой полевой микроскопии, а также развития монослоя на трансвелловых вставках, полученных на пятый день с использованием фазового контраста (E) и (F)) светлопольная микроскопия. 40-кратное увеличение и масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) 2D-монослоя, полученного из энтероидов, на вставках трансвелла. (A) Принципиальная диаграмма того, как TEER измерения монослоя кишечных эпителиальных клеток (IEC) получены с помощью электродов STX2 из палочек для еды вольтомметра, (B) Продольный мониторинг 2D измерений монослоя TEER в течение 12 дней в клеточной культуре. Каждая точка данных представляет собой среднее значение TEER и стандартную ошибку среднего значения (SEM), полученные из двух технических реплик. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6:Дифференцированные 2D монослои, полученные из энтероидов, на трансвелл-вставках превращаются в поляризованные эпителиальные пластинки кишечника. (А-М) Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения 2D-монослоя, полученного из энтероидов, на трансвелл-вставке через 5 дней в культуре, показывающие (A) ядро (синий), (B) E-кадгерин (красный), (C) F-актин (зеленый) и (D) наложение 3 изображений (слияние), (E, I) ядерное окрашивание, (F) хромогранин-A, (J) цитокератин-18, (G,K) лизоцим и (H,L) слияние изображений. (M) Моделирование Z-стека, показывающее распределение одних и тех же белков-маркеров эпителиальных клеток 2D-монослойного листа. Изображения были получены с 2 биологических репликатов. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Первичные 2D-монослои, полученные из энтероидов крупного рогатого скота, на трансвеллерных вставках функционально активны. Секреция супернатантных цитокинов апикальной и базальной культуры клеток (A) IL-1α и (B) IL-8 2D монослоями на трансвелл-вставках через 5 дней в культуре, которая не лечилась или стимулировалась Pam3csk4 в течение 24 ч. Данные репрезентативны для средних уровней цитокинов и SEM из монослоев, полученных из замороженных запасов крипт от одного животного и трех независимых экспериментов. Цитокины количественно определяли с помощью мультиплексного анализа на основе шариков (Таблица материалов) в соответствии с инструкциями производителя и анализировали на компактном блоке мультиплексирования (Таблица материалов) и программном обеспечении для подгонки кривой иммуноанализа (Таблица материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Запасы и конечные концентрации реагентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать таблицу.
Представленный здесь протокол описывает физиологически релевантную модель для исследования физиологии кишечника и кишечных расстройств. Несколько исследовательских групп описали генерацию бычьих энтероидных культур, включая 2D монослои 16,19,20,21,22,23,24. Несмотря на то, что генерация монослоев не является технически сложной задачей, несколько минимальных шагов имеют решающее значение для последовательного развития успешных культур. Таким образом, воспроизводимость 2D-монослоев с использованием кратко описанных в опубликованной литературе методов может быть сложной задачей для исследователя, начинающего изучать органоиды. Протокол, описанный в настоящем документе, адаптирован из этих протоколов и протоколов, опубликованных в других видах, и представляет собой пошаговое руководство по созданию монослоя на трансвелловых вставках, которое отличается высокой воспроизводимостью.
Протокол, изложенный в настоящем документе, может быть легко изменен в соответствии с конкретными целями плана эксперимента или доступностью реагентов. Действительно, следуя этому протоколу, успешные культуры могут быть достигнуты путем посева монослоев при более низкой плотности клеток (например, 2,5 x 104) или при отсутствии FBS, как описано в других публикациях24. Однако для изменения этих параметров может потребоваться увеличение культивирования для создания сливающегося монослоя. Таким образом, если другие факторы, неотъемлемые от дизайна исследования, в том числе совместное культивирование с иммунными клетками, диктуют конкретный временной ход для эксперимента, плотность посева может быть изменена по мере необходимости. Несмотря на то, что другие составы базальных мембран могут быть заменены на те, которые используются в этом протоколе для генерации 3D-энтероидов и 2D-монослоев, они потребуют некоторой оптимизации для определения оптимального соотношения базальной мембраны к среде.
Применение трансвелл-вставок в описанной методике имеет много преимуществ по сравнению с монослойным выращиванием на обычной пластиковой посуде и 3D-энтероидных культурах. По сравнению со стандартными тканевыми культуральными планшетами, использование трансвеллов для монослойных культур способствует клеточной дифференцировке и организации таким образом, что сохраняет сходство с кишечными криптами14,25. Эпителиальный барьер кишечника жизненно важен для предотвращения транслокации токсинов и микроорганизмов в организм, одновременно облегчая всасывание питательных веществ. Таким образом, очень важно понимать, как барьерная целостность кишечника функционирует у здоровых людей и как она изменяется при кишечных расстройствах или в ответ на соединения. В отличие от 3D-энтероидных культур, объективная оценка целостности кишечного барьера возможна при совмещении монослоев на трансвеллах и измерении TEER, как показано в настоящемдокументе 14,25. Генерация 2D-монослоев на трансвеллах также позволяет проводить двойную культуру с соответствующими типами клеток, такими как иммунные или стромальные клетки. Это позволяет охарактеризовать критически важные перекрестные помехи между клетками кишечника и клетками тканевого микроокружения, чего невозможно достичь с помощью 3D-культур. Обнажение апикальной поверхности монослоя позволяет не только экспериментально контактировать с патогенами и соединениями и собирать продукты просвета, но и позволяет изучать другие аспекты физиологии и заболеваний кишечника, включая изучение микробиоты кишечника и физиологии молекулярного всасывания или транспорта13. Независимый контроль над апикальной и базальной поверхностями кишечника является неоспоримым преимуществом перед 3D моделями энтероидов.
Проведя несколько пробных экспериментов, мы определили ключевые шаги, которые способствовали успеху протокола. В то время как образцы цельной кишечной ткани можно хранить в холодильнике в течение ночи и обрабатывать на следующий день, этапы диссоциации тканей и изоляции фрагментов крипт должны быть выполнены быстро, чтобы предотвратить распад изолированных фракций крипты. После завершения промывки PBS центрифугирование крипт в промывочной среде может помочь предотвратить разрушение крипты, как описано в шаге 2.3.10. При прохождении энтероидов или их сборе для формирования монослоя важно отделить энтероиды от куполов BME. Промывочный материал должен быть ледяным, чтобы помочь растворить BME. Напротив, использование предварительно нагретого трипЛЭ и двойная фильтрация клеточной суспензии может помочь сформировать одиночные клетки, необходимые для образования монослоя. Наконец, ручное перемещение пластины в форме цифры 8 может помочь равномерно распределить отдельные ячейки по трансвелл-вставке.
Важным ограничением этого протокола является то, что 2D-монослои были получены из энтероидных пород, полученных от зрелого бычка голштинской породы (>2 года). Созревание желудочно-кишечного тракта у телят может потребовать незначительных изменений в описанном протоколе для получения оптимальных результатов. Породоспецифические различия в физиологии кишечника пород крупного рогатого скота описаны в литературе26. Хотя неизвестно, могут ли эти различия повлиять на энтероиды и последующее образование монослоев, мы подозреваем, что любые различия приведут лишь к незначительным изменениям в нашем протоколе. Кроме того, 2D-модель культуры имеет ряд недостатков. По сравнению с 3D-моделями энтероидов, в 2D-культурах могут отсутствовать некоторые аспекты архитектуры кишечной ткани и клеточного разнообразия, что создает ограничения и проблемы, связанные с распространением 2D-культуры13. Тем не менее, исследования показывают, что некоторые монослои могут эмулировать ожидаемую организацию крипт27, а некоторые из этих ограничений могут быть даже преодолены путем создания 2D-культур с интерфейсом воздух-жидкость. Тем не менее, ограничения этой модели должны быть полностью учтены, чтобы определить, подходит ли ее применение для задаваемого экспериментального вопроса.
Этот протокол описывает оптимизированную систему культивирования, которая моделирует желудочно-кишечный тракт крупного рогатого скота с использованием энтероидов, полученных из подвздошной кишки крупного рогатого скота, для формирования монослоев на трансвелл-вкладышах. Обладая широким спектром применений от исследований инфекционных заболеваний до разработки лекарств и регенеративной медицины, эта высокопроизводительная система культивирования может привести к беспрецедентной разработке профилактических и терапевтических стратегий, которые могут быть взаимовыгодными для здоровья животных и человека.
Мы выражаем признательность за использование Центра клеточного и молекулярного ядра в Университете Среднего Запада.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 mL pipette tip | MidSci | PR-200RK-S | |
1 µm PET 24-well cell culture inserts | Corning | 353104 | |
1000 mL pipette tip | MidSci | PR-1250RK-S | |
22 G needle | Becton, Dickinson and Company | 305156 | |
24-well culture vessel | Corning | 353504 | |
40 μm cell strainer | Corning | 431750 | |
50 mL centrifuge tube | Fisher scientific | 14-955-240 | |
5-mL pipet tip | Fisher scientific | 30075307 | |
5 mL syringe | Becton, Dickinson and Company | 309647 | |
5 mL tube | Eppendorf | 30119401 | |
Anti-Cytokeratin -18 (C-04) | Abcam | AB668-1001 | |
B-27 supplement without vitamin A | Gibco | 12-587-010 | |
Belysa software | Luminex | 40-122 | Immunoassay curve fitting software |
Bovine serum albumin (BSA) | Fisher bioreagents | BP9704-100 | |
Caspofungin acetate | Selleckchem | S3073 | |
Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
Chromogranin-A (E-5) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271738 | |
Coverslips | Fisher scientific | 12-540-C | |
Cryovials | Neptune scientific | 3471.X | |
Cultrex Ultimatrix RGF BME | R&D Systems | BME001-05 | |
DAPI | MilliporeSigma | D9542-5MG | |
Dissecting scissors | VWR | 82027-588 | |
Dithiothreitol (DTT) solution | Thermo Scientific | FERR0861 | |
DMEM/ F-12 1.1 medium (with L-glutamine, without HEPES) | Cytiva | SH30271.01 | |
E-cadherin | Cell Signaling Technology | #3195 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher Scientific | BP2482500 | |
FBS | Corning | MT35070CV | |
Gentamicin | Gibco | 15710064 | |
Glass microscope slide | Fisher scientific | 12-550-07 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
Hemacytometer | Bio-Rad | 1450015 | |
IntestiCult organoid Differentiation medium (Human) | StemCell Technologies | 100-0214 | |
IntestiCult organoid growth medium (Human) | StemCell Technologies | 0-6010 | |
Keyence BZ-X700 | Keyence | BZ-X700 | |
LY2157299 (Galunisertib) | Selleckchem | S2230 | |
MAGPIX system | Luminex | Magpix system | Compact multiplexing unit |
Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
MILLIPLEX Bovine Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel | MilliporeSigma | BCYT1-33K | Bead-based multiplex assay |
Mr. Frosty container | Nalgene | 5100-0001 | |
Non-Enzymatic Cell Dissociation Solution | ATCC | 30-2103 | |
NutriFreeze D10 Cryopreservation Media | Biological Industries | 05-713-1B | |
Orbital shaking platform | Thermo Fisher | 88880021 | |
Pam3Csk4 | invivogen | tlrl-pms | |
Parafilm sealing film | dot scientific inc. | #HS234526C | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Phalloidin-FITC | R&D Systems | 5782/12U | |
Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-20 | |
Prolong Glass Antifade | Invitrogen | P36982 | |
Rabbit anti-human Lyzozyme (EC3.2.1.17) | Agilent technologies | A009902-2 | |
SB202190 (FHPI) | Selleckchem | S1077 | |
Shaking water bath | Thermo Fisher | MaxQ 7000 | |
Sodium Azide | VWR | BDH7465-2 | |
Streptomycin | Teknova | S6525 | |
Trypan Blue dye | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE express enzyme | Life technologies | 12604013 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | |
Voltohmmeter | MilliporeSigma | Millicell ERS-2 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved