구강 칸디다증의 쥐 모델에 대한 커큐미노이드 매개 항균 광역학 요법

요약

이 프로토콜은 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 항균 광역학 요법(aPDT)의 적용을 설명합니다. aPDT는 커큐미노이드와 청색 LED 조명의 수용성 혼합물을 사용하여 수행되었습니다.

초록

항균 광역학 요법(aPDT)은 체외에서 광범위하게 조사되었으며, 감염의 전임상 동물 모델은 임상 시험 전에 대체 치료법을 평가하는 데 적합합니다. 이 연구는 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 aPDT의 효능을 설명합니다. 40마리의 마우스에게 프레드니솔론(prednisolone)을 피하 주사하여 면역을 억제하고, C. 알비칸스(C. albicans) 세포 현탁액에 미리 담근 구강 면봉을 사용하여 혀를 접종하였다. 테트라사이클린은 실험 과정에서 식수를 통해 투여되었습니다. 진균 접종 5일 후, 마우스는 무작위로 8개 그룹으로 분포되었습니다. 치료되지 않은 감염되지 않은 마우스의 아홉 번째 그룹은 음성 대조군으로 포함되었습니다(n=5). 커큐미노이드 혼합물의 세 가지 농도(20μM, 40μM 및 80μM)를 청색 LED 조명(89.2mW/^cm2; ~455nm)과 조명 없음(각각 C+L+ 및 C+L- 그룹)으로 테스트했습니다. 가벼운 단독(C-L+), 무처리(C-L-), 감염되지 않은 동물을 대조군으로 평가했습니다. 데이터는 Welch의 ANOVA 및 Games-Howell 검정(α=0.05)을 사용하여 분석되었습니다. 구강 칸디다증은 감염된 모든 동물에서 확립되었으며 혀의 등쪽에 특징적인 흰색 반점 또는 가성막의 존재를 통해 거시적으로 시각화되었습니다. 조직병리학적 절편은 C-L-그룹 내 상피의 각질화된 층에 국한된 효모와 필라멘트의 다량의 존재를 확인했으며, 40μM 또는 80μM 커큐미노이드를 사용하여 aPDT를 투여한 마우스에서 얻은 이미지에서 진균 세포의 존재가 시각적으로 감소했습니다. 80μM 커큐미노이드에 의해 매개된 aPDT는 C-L-그룹에 비해 콜로니 수가 2.47 log₁₀ 감소하는 것을 촉진했습니다(p=0.008). 다른 모든 그룹은 광감작제(C+L-) 또는 빛 단독(C-L+) 그룹을 포함하여 콜로니 수에서 통계적으로 유의한 감소를 보이지 않았습니다. 커큐미노이드 매개 aPDT는 쥐의 혀에서 나오는 곰팡이 부하를 줄였습니다.

서문

구강 칸디다증(OC)은 구강의 주요 곰팡이 감염입니다. 그것은 칸디다 종(Candida spp)의 과잉 증식으로 인해 발생합니다. 난소염의 발병 원인으로는 내분비 기능 장애, 광범위 항생제 사용, 방사선 및 화학 요법, 영양 결핍, 구강 건조증(낮은 타액 흐름), 의치 사용, 위생 불량, 특히 면역 억제^{등이 있다 1}. 칸디다 종 중에서 칸디다 알비칸스(Candida albicans )가 가장 널리 퍼져 있고 독성이 강합니다. 그것은 인체에서 공생 종으로 발견되며 기회 병원체로 발견됩니다. C. albicans 는 공생 효모(blastopores)에서 병원성 필라멘트(균사 및 pseudohyphae)로 형태를 변경할 수 있는 능력이 있습니다.². 사상체, 특히 균사는 세포내이입(endocytosis) 또는 능동적 침투를 통해 숙주 상피에 침입하여 감염을 일으킬 수 있다³. 알비칸스(C. albicans )의 다른 독성 인자로는 리파아제(lipase), 포스포리파제(phospholipase), 단백질 분해 효소(proteinase), 칸디다리신(candidalysin)과 같은 지방 분해 및 가수분해 효소 및 독소의 부착, 생물막 형성, 분비 등이 있다⁴.

OC 치료에는 항진균제, 특히 국소 폴리엔 및 아졸(니스타틴 및 미코나^졸)의 사용이 포함됩니다5. 그러나 단기적인 효능만 보이며 재발이 잦다. 또한 항진균제의 남용은 항진균제 내성 발달 및 확산 문제를 야기하고^{있다 6}. 따라서 산소가 있는 상태에서 적절한 파장(PS 흡수와 동일)에서 광감작제(PS)와 빛을 결합하는 항균 광역학 요법(aPDT)과 같은 대체 요법이 필요합니다. PS는 세포에 결합하거나 세포에 흡수되며, 빛에 의해 활성화되면 감작된 세포에 독성이 있는 활성산소종(ROS)을 생성한다⁷.

aPDT에서 사용되는 광감작제(PSs) 중 하나는 강황 식물(Curcuma longa L.)의 뿌리줄기에서 추출한 자연 발생 화합물인 커큐민(CUR)입니다. 커큐민은 항염증, 항산화, 항암 및 항균 기능을 포함한 수많은 치료 특성을 가지고 있습니다 ^8,9. 선행 조사에 따르면 CUR을 활용한 aPDT는 숙주의 조직에 해를 끼치지 않으면서 구강 칸디다증의 쥐 모델에서 C. 알비칸스를 효과적으로 감소시켰다¹⁰. CUR은 강황에서 추출한 주요 커큐미노이드이지만 데메톡시커큐민 및 비스-데메톡시커큐민과 같은 다른 폴리페놀도 이 식물에서 발견됩니다. 커큐미노이드 매개 aPDT는 카테터에서 성장한 황색포도상구균의 생물막에 대한 항균 활성을 입증했다¹¹. 그러나 우리가 아는 한, C. albicans에 대한 항진균 활성은 불분명합니다. 따라서 이 연구에서는 OC의 쥐 모델에서 C. albicans에 대해 커큐미노이드 염에 의해 매개되는 aPDT를 평가했습니다.

프로토콜

마우스 사용에 대한 연구 프로토콜은 UNESP의 Araraquara에 있는 School of Dentistry의 동물 사용 윤리 위원회(사례 번호 05/2008 및 09/2020)의 승인을 받았습니다. C. albicans (ATCC 90028)를 기준 균주로 사용하였다. 20-30g의 체질량 범위를 가진 6주 된 암컷 스위스 마우스(n=45)가 본 연구에 사용되었습니다. 동물들은 상파울루 주립 대학, UNESP, 보투카투에서 제공했습니다.

1. PS 준비 및 aPDT용 광원 선택

1. 테스트할 물질의 사양에 따라 PS를 준비합니다.
   참고: 이 연구에서는 커큐미노이드의 수용성 혼합물(CUR 기반 수용성 염 혼합물¹²)을 PS로 사용했습니다( 재료 표 및 그림 1 참조). 20μM, 40μM, 80μM(각각 15.6, 29.2, 58.4mg/L)의 희석액을 사용 직전 초순수에서 준비하여 5°C에서 보관하였다.
2. 조직을 가열하지 않고 전체 감광성 대상을 균일하고 동시에 비출 수 있는 적절한 파장(PS 흡수와 동일)을 가진 조명 장비를 선택하십시오.
   참고: 이 연구에서는 Instituto de Física de São Carlos(브라질 상파울루 대학교, São Carlos, SP)에서 설계한 발광 다이오드(LED, 재료 표 참조)가 포함된 핸드피스를 사용했습니다. 빛에 의해 전달되는 출력 전력은 약 455nm의 청색 파장에서 89.2mW/^cm2 였습니다.

2. C. albicans 접종물의 제조

1. 효모-펩톤-포도당(YEPD, 재료 표 참조)의 기준 균주 C. albicans(ATCC 90028)를 사용할 때까지 -80°C에서 50% 글리세롤과 함께 보관하십시오.
2. 냉동 균주를 실온에서 해동하고, 클로람페니콜(재료 표 참조)이 포함된 Sabouraud 포도당 한천(SDA)을 사용하여 페트리 접시에 100μL 부분 표본을 펴 바르고, 37°C에서 48시간 동안 배양합니다.
3. 5 콜로니를 2 % 포도당 (YNBg) 배지와 함께 10 mL의 효모 질소 브로스에 옮기고 37 ° C에서 16 시간 동안 호기성 적으로 성장시킵니다.
4. 효모 배양액을 신선한 YNBg(1:10)로 희석하고 optical density가 mid-log 성장 단계에 도달할 때까지 37°C에서 호기성 배양합니다.
   참고: 이전에 각 실험실의 미생물 성장 곡선을 표준화했습니다. 현재 연구에서 배양물은 540nm(OD₅₄₀)에서 광학 밀도로 표시된 성장의 중간 로그 단계에 도달할 때까지 약 8시간 동안 배양하도록 허용되었으며, 평균값은 0.536 ± 0.062 임의 단위(평균 ± 표준 편차[SD])입니다.
5. 배양액을 실온에서 5,000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 동일한 부피의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS; 0.136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7.4)로 펠릿을 두 번 세척합니다.
6. PBS에서 4개의 연속 10배 희석을 수행하기 위해 100μL 분취액을 사용하고, SDA 플레이트에 희석액을 퍼뜨리고, 콜로니 계수를 위해 37°C에서 48시간 동안 배양합니다. 표준으로, 곰팡이 현탁액은 약 4.5 × 10⁷ 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU/mL)]의 농도로 사용됩니다.

3. 생쥐에서 OC 유도

참고 : 다음 방법론은 이전에 Takakura et ^al.13에 의해 설명되었으며 일부 수정을 거쳐 그룹^10,14에 의해 재현되었습니다.

1. 마우스를 동일한 처리 횟수에 해당하는 9개 그룹(n=5)으로 무작위 분포시킵니다(보충 파일 1).
   참고: 생쥐의 구강은 칸디다 성장에 대해 음성이어야 합니다. 이것은 구강을 면봉으로 닦고 SDA에 샘플을 도금하여 확인해야 합니다.
2. 동물을 프로필렌 상자¹⁰(상자당 최대 5마리)에 보관하고 바닥재용 나무 부스러기를 사용하여 23/2± 12시간 밝음/어두움 주기에서 23°C의 온도 제어 비바리움에 보관합니다. 특정 보강을 제공할 필요가 없습니다.
3. 압출된 마우스 식단과 여과된 물을 사용하여 마우스를 유지합니다.
4. 면역억제제인 프레드니솔론(체중 100mg/kg, 자료표 참조)을 C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ 및 C-L-그룹의 모든 구성원에게 첫날에 처음으로 피하 주사합니다(보충 파일 1).
   알림: 같은 그룹의 쥐를 같은 상자에 보관하고 스트레스와 체중 감소의 징후가 있는지 매일 모니터링하십시오. 스트레스나 체중 감소가 나타나는 경우 진통제 또는 변경된 음식/물에 대한 수의사의 조언을 구하십시오..
5. 첫날부터 실험이 끝날 때까지 테트라사이클린 염산염을 음용수에 0.83mg/mL로 제공합니다¹³.
6. C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ 및 C-L-(보충 파일 1)을 포함한 마우스 혀를 C. albicans 접종물로 2일째에 접종합니다. 음성 대조군(NCtrl)의 마우스를 접종하지 마십시오.
   1. 접종을 수행하기 전에 각 허벅지 근육에 10mg/kg 클로르프로마진 클로라이드( 재료 표 참조)를 근육 주사하여 동물을 진정시킵니다.
   2. 멸균 면봉(동물당 1개)을 C. albicans의 새로 준비된(즉, 접종 직전에 준비된) 표준화된 현탁액에 담가 마우스의 경구 내 접종을 수행합니다.
   3. 진정제를 투여한 쥐를 누운 자세로 눕힙니다. 멸균 집게를 사용하여 입에서 혀를 부드럽게 빼냅니다. 적신 면봉으로 각 쥐의 혀를 30초 동안 문지릅니다. 진정제에서 회복될 때까지 쥐를 모니터링하십시오.
7. 5일째에는 프레드니솔론(체중 100mg/kg)을 보완적으로 피하주사하여 면역억제를 유지합니다.
   참고: 이 프로토콜은 경구 내 접종 후 7일 동안 감염을 유지하는 데 적합합니다. 프로토콜 타임라인은 그림 2에 나와 있습니다.

4. 항균 광역학 요법 및 구강 병변에서 C. albicans의 회복

1. 7일째, 치료 전, 케타민 염산염(체중 100mg/kg)과 자일라진(체중 10mg/kg)을 결합한 복강내 주사를 사용하여 동물을 마취시킨다( 재료 표 참조).
2. 입을 벌리기 위해 앞니 주위에 고리를 걸 수 있는 스테인리스강 와이어가 장착된 패드 장치^(14,15) 위에 각 동물을 앙와위 자세로 놓는다.
   참고: 등온 패드는 진정제를 투여하는 동안 쥐를 따뜻하게 하고, 실온에서 저체온증을 예방하며, 마취와 관련된 사망을 방지하기 위해 권장됩니다¹⁵. 마취된 각 동물은 마취 깊이를 확인하기 위해 발가락을 꼬집었을 때 금단 반사가 없는지 모니터링해야 합니다. 필요한 경우 원래 용량(자일라진 제외)의 1/3로 케타민을 1회 유지 투여할 수 있습니다.
3. 하악골과 뺨을 접은 상태에서 혀를 입 밖에 부드럽게 놓습니다.
4. C+L+ 그룹의 마우스의 경우 혀의 등쪽에 70μL의 PS를 피펫팅합니다(테스트된 농도 중 하나에서). 방사선 조사 전 기간으로 20분 동안 어두운 환경에서 마우스를 유지합니다. 이 시간 동안 각 동물의 혀가 구강 내부에 위치하여 감광제(PS)가 섭취되는 것을 방지해야 합니다.
5. 광감작 기간이 지나면 빛을 위해 혀를 입에서 빼냅니다. LED 장치를 혀의 등쪽에 놓고 37.5J/^cm2 (현재 장치로 7분)로 조명을 켭니다(그림 3).
6. C+L- 그룹의 동물의 경우, 혀의 등쪽에 테스트된 농도 중 하나에서 PS의 70μL를 피펫팅하고 이 마우스를 27분 동안 어둠 속에 보관합니다.
7. C-L+ 그룹(광감작 없이 빛으로 처리)의 동물의 경우, 혀의 등쪽에 멸균 식염수 70μL를 피펫팅합니다. 쥐를 20분 동안 어둠 속에 두었다가 37.5J/^cm2 (현재 장치로 7분)로 혀를 비춥니다.
8. C-L- 그룹의 마우스(PS나 빛으로 처리하지 않음)의 경우 혀의 등쪽에 70μL의 멸균 식염수를 피펫팅하고 27분 동안 어두운 곳에 보관합니다.
9. 치료 직후 모든 쥐의 혀에서 C. albicans를 회수하십시오. 멸균 면봉으로 혀의 등쪽을 1분 동안 면봉으로 닦습니다.
10. 각 샘플 면봉을 1mL의 멸균 식염수와 와류가 들어 있는 튜브에 1분 동안 넣어 미생물 세포를 재현탁시킵니다.
11. PBS에서 10배 연속 희석을 즉시 수행하고 SDA 플레이트에 25μL 부분 표본을 중복으로 플레이트합니다. 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 호기적으로 배양합니다.
12. 48시간 후 디지털 콜로니 카운터( 재료 표 참조)를 사용하여 효모 콜로니 수를 결정합니다. 각 동물에 대한 C. albicans 부하(CFU/mL)를 계산합니다.
13. CFU/mL 값을 로그₁₀ 으로 변환하고 실험 설계 및 데이터 가정에 따라 적절하게 분석합니다.
    참고: 본 연구에서는 Welch의 일원 분산 분석 및 Games-Howell 사후 검정(α = 0.05)¹⁶ 이 사용되었습니다.

5. 조직병리학적 분석

1. 8일째에는 복강내 주사를 통해 100mg/kg의 케타민과 10mg/kg의 자일라진을 병용하여 마우스를 마취하고 케타민(200mg/kg을 골막내 주사로 투여)으로 안락사시킵니다. 호흡 운동의 부재(무호흡)와 심장 박동의 부재(무수축)를 확인하여 사망을 확인합니다.
2. 혀를 조심스럽게 꼬집어 동물의 입에서 빼냅니다. 수동 메스를 사용하여 유두 주위를 절개하여 전방 및 중앙 부위에 부상을 입히지 않고 혀 전체를 외과적으로 제거합니다.
3. 혀를 10% 완충 포르말린(pH 7.2-7.4)에 24시간 동안 고정하고 흐르는 물에 2시간 동안 씻습니다.
4. 파라핀 공정에 포함을 진행하십시오 : 탈수, 정화 및 함침^10,14.
5. 마이크로톰을 사용하여 연속 섹션(5μm 두께)을 자른 다음 섹션을 유리 슬라이드에 부착합니다. 조직병리학적 검사를 위해 주기적인 acid-Schiff 및 hematoxylin(PAS-H)을 사용하여 이러한 절편을 염색하고 광학 현미경으로 관찰하여 곰팡이를 식별합니다.
6. 가급적이면 연구 대상 그룹에 대해 맹목적인 병리학자에게 C. albicans 감염으로 인한 조직 반응을 검사하도록 요청하십시오.
7. 조직(상피 및 결합 조직)의 조직학적 특성, 특히 다양한 강도의 국소 염증 반응을 설명합니다.

결과

OC의 쥐 모델은 모든 감염된 쥐의 혀에 전형적인 흰색 반점과 가성막을 보여주었습니다(그림 4A). C-L- 동물로부터 회수 된 C. 알비칸스는 이 미생물에 의한 조직 집락화를 확인하였다(값은 1.62 x 10⁴ 내지 4.80 x 10⁵ CFU/mL 범위였다). 예상대로, NCtr 그룹의 동물은 샘플링 후 조직 변화나 콜로니 성장을 나타내지 않았습니다(그림 4B).

토론

C. 알비칸스(C. albicans)는 면역 저하 상태, 진성 당뇨병, 항생제 장기간 사용, 구강 위생 불량 등의 구강 및 식도 감염과 관련이 있다 ^1,3. 인간 감염성 질환 연구는 임상시험을 안전하고 정확하게 설계하기 전에 체외 및 생체 내 조사가 모두 필요합니다. 본 연구는 C. albicans에 의한 구강 감염의 발병기전과 항진균제 접근법의 효능...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow