Куркуминоид-опосредованная антимикробная фотодинамическая терапия на мышиной модели кандидоза полости рта

Summary

Этот протокол описывает применение антимикробной фотодинамической терапии (ФДТ) на мышиной модели кандидоза полости рта. ФДТ проводили с использованием водорастворимой смеси куркуминоидов и синего светодиодного света.

Abstract

Антимикробная фотодинамическая терапия (ФДТ) была широко исследована in vitro, а доклинические модели инфекций на животных подходят для оценки альтернативных методов лечения до клинических испытаний. В этом исследовании описывается эффективность аФДТ на мышиной модели кандидоза полости рта. Сорок мышей были иммуносупрессивно введены с помощью подкожных инъекций преднизолона, а их языки были инокулированы с помощью мазка из ротовой полости, предварительно смоченного в клеточной суспензии C. albicans . В ходе эксперимента тетрациклин вводили с питьевой водой. Через пять дней после инокуляции грибка мыши были случайным образом распределены на восемь групп; Девятая группа необработанных неинфицированных мышей была включена в качестве отрицательного контроля (n = 5). Три концентрации (20 мкМ, 40 мкМ и 80 мкМ) смеси куркуминоидов были протестированы с синим светодиодным светом (89,2 мВт/^см2; ~455 нм) и без света (группы C+L+ и C+L- соответственно). В качестве контрольной группы оценивали только свет (C-L+), отсутствие лечения (C-L-) и животных без инфекции. Данные анализировали с помощью тестов Уэлча ANOVA и Геймса-Хауэлла (α = 0,05). Кандидоз полости рта был установлен у всех инфицированных животных и визуализировался макроскопически по наличию характерных белых пятен или псевдомембран на тыльной стороне языка. Гистопатологические срезы подтвердили большое присутствие дрожжей и филаментов, ограниченных ороговевшим слоем эпителия в группе C-L-, а присутствие грибковых клеток было визуально снижено на изображениях, полученных от мышей, подвергшихся ФДТ куркуминоидами 40 мкМ или 80 мкМ. ФДТ, опосредованная 80 мкМ куркуминоидами, способствовала снижению количества колоний на 2,47 log₁₀ по сравнению с таковыми в группе C-L- (p = 0,008). Во всех остальных группах не было выявлено статистически значимого снижения количества колоний, включая группы фотосенсибилизаторов (C+L-) или только света (C-L+). Куркуминоид-опосредованная аФДТ снижала грибковую нагрузку от языков мышей.

Introduction

Кандидоз полости рта (ОК) – основная грибковая инфекция ротовой полости; это вызвано чрезмерным ростом Candida spp. Предрасполагающие факторы к ОК включают эндокринную дисфункцию, применение антибиотиков широкого спектра действия, радио- и химиотерапию, дефицит питательных веществ, ксеростомию (низкий поток слюны), ношение зубных протезов, плохую гигиену и, особенно, иммуносупрессию¹. Среди видов Candida Candida albicans является наиболее распространенным и вирулентным; Он обнаруживается в организме человека как комменсальный вид и как условно-патогенный микроорганизм. C. albicans обладает способностью изменя....

Protocol

Протокол исследования по использованию мышей был одобрен Комитетом по этике использования животных (номера дел 05/2008 и 09/2020) в Школе стоматологии, Араракура, UNESP. В качестве референтного штамма использовали C. albicans (ATCC 90028). Для настоящего исследования были использованы шестинедельны?.......

Discussion

C. albicans ассоциировался с инфекциями полости рта и пищевода у лиц с ослабленным иммунитетом, сахарным диабетом, длительным приемом антибиотиков и плохой гигиеной полости рта ^1,3. Изучение инфекционных заболеваний человека требует исследований как in.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. albicans	ATCC (Rockville, Md, USA)	90028	Used to prepare the Candida inoculum
Centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5804/5804R,B. Braun, Melsungen, Hesse, Germany	022628146 (NA)	Used to prepare the Candida inoculum
Chlorpromazine chloride 2 mg/mL	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to sedate animals during candida inoculation
Curcumin-based water-soluble salt	PDTPharma, Cravinhos, Brazil	-	Consisting of 53.4% of natural curcumin, and  46.6% of other curcuminoids (demethoxycurcumin and bis-demethoxycurcumin). Prepared in water and N-MethylD-Glucamine (final average molecular weight of 730.32 g.mol−1)
Digital colony counter	CP 600 Plus, Phoenix Ind Com Equipamentos Científicos Ltda, Araraquara, SP, Brazil	-	Used to count colonies on agar plates
Extruded mouse chow	Benelab food, Industry Qualy Animal Nutrition and Commerce Ltda., Lindóia, São Paulo State, Brazil.	-	Used for the feeding of the mice
Ketamine Hydrochloride 10%	Ketamina Agener, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used to anesthetize animals before  treatments and for euthanasia
Light-emitting diode handpiece (prototype)	Instituto de Física de São Carlos, University of São Paulo, São Carlos, SP, Brazil	-	Fabricated with LXHL-PR09, Luxeon III Emitter, Lumileds Lighting, San Jose, California, USA
Methylprednisolone acetate 40 mg	DEPO-MEDROL, Pfizer, New York	-	Used as an immunosuppressant
Microtome	Leica Microsystems, Bannockburn, IL, USA	SM2500	Used to cut the serial sections of the tongues
Propylene boxes (cages housing) H13 x L20 x D30 cm	Bonther Equipaments, Ribeirão Preto, SP, Brazil	-	Used to keep the animals throughout  the experimental period
Sabouraud Dextrose Agar with Chloramphenicol	HiMedia, Mumbai, India	MM1067-500G	Culture medium for yeast growth (agar)
Spectrophotometer	Spectrophotometer Kasvi K37-VIS , São José dos Pinhais, PR, Brazil	K37-VIS	Used to standardize the inoculum concentration
Tetracycline hydrochloride	Compounding pharmacy, Araraquara, SP, Brazil	-	Antibiotic given to induce oral dysbiosis
Wood shavings	J.R. Wood Shavings, Comerce of Sawdust Ltda., Conchal, São Paulo State, Brazil	-	Used for floor covering inside the housing boxes
Xylazine 2%	Calmiun, União Química Farmacêutica Nacional S/A, Embu-Guaçu, SP, Brazil	-	Used in combination with ketamine for anesthesia
Yeast Nitrogen Broth	Difco, InterLab, Detroit, MI, USA	DF0919-07-3	Culture medium for yeast growth (broth)
Yeast Peptone Dextrose Broth	NutriSelect Basic, Sigma Aldrich	Y1375	Culture medium for maintaining the strains at -80°C and grow