Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בקטריופאג'ים (פאגים), נגיפים שמדביקים חיידקים, הם מרכיב אינטגרלי של מיקרוביום המעי. אף על פי שהתושבים הסימביוטיים האלה מניעים את הכושר החיידקי ואת דינמיקת האוכלוסייה, מעט מאוד מובן על האופן שבו הם משפיעים על הומאוסטזיס מעיים ומחלות. פרוטוקול זה חוקר פאגים T4 מבודדים בתוך מודל עכברי, הניתן להתאמה לזוגות פאגים-חיידקים אחרים.

Abstract

בקטריופאג'ים (פאג'ים) הם וירוסים שמדביקים חיידקים ברמת המינים והזנים, והם הישויות הביולוגיות הנפוצות ביותר בכל המערכות האקולוגיות הידועות. בתוך קהילות חיידקים, כמו אלה שנמצאות במיקרוביוטה של המעיים, פאגים מעורבים בוויסות הדינמיקה של אוכלוסיית המיקרוביוטה ובהנעת אבולוציה חיידקית. בעשור האחרון התעורר עניין מחודש במחקר פאגים, בין השאר הודות ליכולות ההרג הספציפיות לפונדקאי של פאגים ליטיים, המציעים כלי מבטיח נגד האיום הגובר של חיידקים עמידים מיקרוביאלית. יתר על כן, מחקרים אחרונים המוכיחים כי פאגים נצמדים לליחה במעי מצביעים על כך שייתכן שיש להם תפקיד מגן במניעת פלישת חיידקים לאפיתל הבסיסי. חשוב לציין, שבדומה למיקרוביום חיידקי, פגיאומים משובשים נקשרו להחמרה בתוצאות במחלות כמו מחלות מעי דלקתיות. מחקרים קודמים הראו כי פאגים יכולים לווסת את המיקרוביום של בעלי חיים ובני אדם באמצעות השתלות תסנין צואה, מה שיועיל לבריאות הפונדקאי. עם גל המחקר האחרון מגיע הצורך לבסס ולתקנן פרוטוקולים לחקר פאגים בהקשר של מיקרוביום המעי. פרוטוקול זה מספק סדרה של נהלים לחקר פאגים מבודדים מסוג T4 והפונדקאי החיידקי שלהם, Escherichia coli, בהקשר של מערכת העיכול של מורין. השיטות המתוארות כאן מתארות כיצד להתחיל מליזט פאגים, לתת אותו לעכברים ולהעריך את ההשפעות על רמות החיידקים המארח והפאגים. פרוטוקול זה יכול להשתנות ולהיות מיושם על זוגות פאג'ים-חיידקים אחרים, והוא מספק נקודת מוצא לחקר הדינמיקה של פונדקאי-פאג'ים in vivo.

Introduction

בקטריופאג'ים, או פאגים, הם וירוסים שמדביקים והורגים חיידקים עם מינים וספציפיות ברמת הזן1. פאגים ממלאים תפקידים חשובים בקהילות חיידקים מורכבות כמו מיקרוביוטת המעיים, שם הם היו מעורבים בוויסות דינמיקת האוכלוסייה ובהנעת כושר חיידקי2. במהלך העשור האחרון, התעורר עניין מחודש במחקר פאגים עקב עלייתם של פתוגנים עמידים אנטי-מיקרוביאליים3, והפוטנציאל לטיפול בפאגים כאסטרטגיית טיפול אלטרנטיבית. בשנים האחרונות נעשה שימוש בקוקטיילים של פאגים ליטיים דרך הווריד בהצלחה מסוימת בזיהומים ספטיים חיידקיים חמורים ועמידים לאנטיביוטיקה בבני אדם 3,4. טיפול בפאגים דר....

Protocol

כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של UBC והפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית (A23-0113, B19-0038). עכברים שוכנו באוניברסיטת קולומביה הבריטית בתנאים נטולי פתוגנים במרכז למידול מחלות. עכברי C57BL/6 גודלו בתוך המתקן במבודד סרט גמיש סטרילי, שסופק עם תזונת ע.......

Representative Results

כדי לחקור את יחסי הגומלין בין פאג T4/E. coli dyad במעי המורין, פאג T4 וליזטים של כלי רכב הוכנו, נוקו וטוהרו (איור 1A). ליזטים של פאגים T4 כוסו על ידי בדיקת פלאק ונמהלו ל-2 x 10,7 pfu/mL (2 x 10,6 pfu/mouse) במאגר SM. גם ליזטים של כלי רכב עברו טיטור כדי לוודא שאין נוכחות פאגים בת קיימא ונמ?.......

Discussion

חקר הפאגים במיקרוביום מהווה אתגר משמעותי בהשוואה למקביליהם החיידקיים. באופן ספציפי, פאגים אינם מכילים סמן פילוגנטי שמור המשותף לכל הפאגים בדומה לתת-היחידות הריבוזומליות 16S ו-18S המאפשרות את הקלות בריצוף ובזיהוי של מינים פרוקריוטים ואיקריוטים, בהתאמה42. עם זאת, עם ההתקדמות בגיש.......

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מכירים בכך שהאדמה שעליה ביצעו את המחקר הזה היא הטריטוריה המסורתית, הקדומה והבלתי מוגבלת של אומת המוסקאם (xwməθkwəy̓əm). הארץ עליה היא ממוקמת תמיד הייתה מקום למידה עבור אנשי מוסקאם, שבמשך אלפי שנים העבירו הלאה את תרבותם, ההיסטוריה והמסורות שלהם מדור לדור באתר זה. אנו מעודדים אחרים ללמוד עוד על אדמות הילידים שבהן הם חיים ועובדים https://native-land.ca. המחברים מודים על תמיכת המועצה למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) מלגות לתואר שני - תואר שני (N.P.), פרס מייקל סמית 'מחקר בריאות BC Trainee Award (RT-2023-3174, ל- MH), מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) תוכנית מענקי גילוי (RGPIN-2019-04591 ל- C.T., RGPIN-2016-04282 ל- LCO), המכון הקנדי למחקר מתקדם / בנ....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-octanol (99%)ThermofisherCAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter UnitsMillipore Sigma SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)Fisher BioReagents BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100Millipore SigmaUFC910008
BD Microtainer® Tubes, SSTBD Medical365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages) Techiplast1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction ModuleBioRad1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)Fisher BioReagentsBP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pkAndwin Scientific 16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)FisherC298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)Crosman Corporation0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)Thermo Scientific 69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo Scientific K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2OSigma AldrichE7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™ Fisher BioreagentsBP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox Fisher BioreagentsBP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA LadderThermo Scientific SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxnsQuantaBio95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATEDTechiplastUISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrateFisher BioReagentsBP213-1
MaxQ 6000 Incubated ShakerThermo Scientific 8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - LennoxFisher BioReagentsBP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2mlFisher14-666-315
Parafilm sealing filmBemisPM-996
Phage stocksCarolina Biological Supply n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXTLabDiet5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo Scientific A39552S
RNase A (17,500 U)Qiagen19101
RNase-free DNase SetQiagen 79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)Fisher ChemicalBP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ChemicalS271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)Fisher scentific n/a
Sterile flexible film isolator Class Biologically Clean n/a
SYBR™ Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
T100 Thermal Cycler BioRad1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)IDTn/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)IDTn/a
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, UltrapureThermo Scientific AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)Fisher BioReagentsBP2484100

References

  1. Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
  2. Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. C....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203T4

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved