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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

I batteriofagi (fagi), virus che infettano i batteri, sono parte integrante del microbioma intestinale. Sebbene questi abitanti simbiotici guidino la fitness batterica e le dinamiche di popolazione, si sa poco su come influiscono sull'omeostasi intestinale e sulle malattie. Questo protocollo studia i fagi T4 isolati all'interno di un modello murino, adattabile ad altre coppie fago-batterio.

Abstract

I batteriofagi (fagi) sono virus che infettano i batteri con specificità a livello di specie e ceppo e sono le entità biologiche più abbondanti in tutti gli ecosistemi conosciuti. All'interno delle comunità batteriche, come quelle che si trovano nel microbiota intestinale, i fagi sono implicati nella regolazione delle dinamiche di popolazione del microbiota e nel guidare l'evoluzione batterica. Nell'ultimo decennio c'è stato un rinnovato interesse per la ricerca sui fagi, in parte a causa delle capacità di uccisione dei fagi litici specifici per l'ospite, che offrono uno strumento promettente per contrastare la crescente minaccia dei batteri resistenti agli antimicrobici. Inoltre, recenti studi che dimostrano che i fagi aderiscono al muco intestinale suggeriscono che potrebbero avere un ruolo protettivo nel prevenire l'invasione batterica nell'epitelio sottostante. È importante sottolineare che, come i microbiomi batterici, i fageomi interrotti sono stati associati a esiti peggiori in malattie come le malattie infiammatorie intestinali. Studi precedenti hanno dimostrato che i fagi possono modulare il microbioma degli animali e degli esseri umani attraverso trapianti di filtrato fecale, a beneficio della salute dell'ospite. Con questa recente ondata di ricerca arriva la necessità di stabilire e standardizzare protocolli per lo studio dei fagi nel contesto del microbioma intestinale. Questo protocollo fornisce una serie di procedure per studiare i fagi T4 isolati e il loro ospite batterico, Escherichia coli, nel contesto del tratto gastrointestinale murino. I metodi qui descritti delineano come partire da un lisato fagico, somministrarlo ai topi e valutare gli effetti sui livelli di ospite batterico e fagico. Questo protocollo può essere modificato e applicato ad altre coppie fago-batterio e fornisce un punto di partenza per lo studio delle dinamiche ospite-fago in vivo.

Introduction

I batteriofagi, o fagi, sono virus che infettano e uccidono i batteri con specificità a livello di specie e ceppo1. I fagi svolgono un ruolo importante all'interno di comunità batteriche complesse come il microbiota intestinale, dove sono stati implicati nella regolazione delle dinamiche di popolazione e nel guidare la fitness batterica2. Nel corso dell'ultimo decennio, c'è stato un rinnovato interesse per la ricerca sui fagi a causa dell'aumento dei patogeni resistenti agli antimicrobici3 e del potenziale della terapia fagica come strategia di trattamento alternativa. Negli ultimi anni, i cocktai....

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida stabilite dai protocolli approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'UBC e dal Comitato per la sicurezza biologica (A23-0113, B19-0038). I topi sono stati ospitati presso l'Università della British Columbia in condizioni prive di agenti patogeni presso il Center for Disease Modelling. I topi C57BL/6 sono stati allevati all'interno della struttura in un isolatore sterile a film flessibile, dotato di dieta sterile per topi, acqua, lettie.......

Representative Results

Per studiare le interazioni tra la diade fago T4/E. coli nell'intestino murino, sono stati preparati, puliti e purificati i lisati del fago T4 e del veicolo (Figura 1A). I lisati fagici T4 sono stati titolati mediante test a placca e diluiti a 2 x 107 pfu/mL (2 x 106 pfu/topo) in tampone SM. I lisati del veicolo sono stati anche titolati per confermare l'assenza di fagi vitali e diluiti nello stesso volume di tampone SM del lisato fagico T4. I livelli di endoto.......

Discussion

Lo studio dei fagi nel microbioma presenta una sfida significativa rispetto alle loro controparti batteriche. In particolare, i fagi non contengono un marcatore filogenetico conservato comune a tutti i fagi affini alle subunità ribosomiali 16S e 18S che consentono la facilità di sequenziamento e identificazione delle specie procariotiche ed eucariotiche,rispettivamente. Tuttavia, con i progressi negli approcci di sequenziamento di nuova generazione, tra cui l'aumento della lunghezza di lettura, .......

Acknowledgements

Gli autori riconoscono che la terra su cui hanno eseguito questa ricerca è il territorio tradizionale, ancestrale e non ceduto della nazione xwməθkwəy̓əm (Musqueam). Il terreno su cui si trova è sempre stato un luogo di apprendimento per il popolo Musqueam, che per millenni ha tramandato la sua cultura, la sua storia e le sue tradizioni da una generazione all'altra in questo sito. Incoraggiamo gli altri a conoscere meglio le terre native in cui vivono e lavorano in https://native-land.ca. Gli autori riconoscono il sostegno del Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) Canadian Graduate Scholarships - Master's (NP), Michael Smith Health Research BC Tra....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-octanol (99%)ThermofisherCAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter UnitsMillipore Sigma SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)Fisher BioReagents BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100Millipore SigmaUFC910008
BD Microtainer® Tubes, SSTBD Medical365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages) Techiplast1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction ModuleBioRad1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)Fisher BioReagentsBP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pkAndwin Scientific 16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)FisherC298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)Crosman Corporation0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)Thermo Scientific 69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo Scientific K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2OSigma AldrichE7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™ Fisher BioreagentsBP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox Fisher BioreagentsBP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA LadderThermo Scientific SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxnsQuantaBio95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATEDTechiplastUISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrateFisher BioReagentsBP213-1
MaxQ 6000 Incubated ShakerThermo Scientific 8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - LennoxFisher BioReagentsBP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2mlFisher14-666-315
Parafilm sealing filmBemisPM-996
Phage stocksCarolina Biological Supply n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXTLabDiet5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo Scientific A39552S
RNase A (17,500 U)Qiagen19101
RNase-free DNase SetQiagen 79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)Fisher ChemicalBP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ChemicalS271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)Fisher scentific n/a
Sterile flexible film isolator Class Biologically Clean n/a
SYBR™ Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
T100 Thermal Cycler BioRad1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)IDTn/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)IDTn/a
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, UltrapureThermo Scientific AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)Fisher BioReagentsBP2484100

References

  1. Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
  2. Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. C....

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