Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Бактериофаги (фаги), вирусы, заражающие бактерии, являются неотъемлемым компонентом микробиома кишечника. Хотя эти симбиотические обитатели управляют бактериальной приспособленностью и динамикой популяции, мало что известно о том, как они влияют на гомеостаз кишечника и болезни. Этот протокол изучает изолированные фаги Т4 в мышиной модели, адаптируемые к другим фаго-бактериальным парам.

Abstract

Бактериофаги (фаги) — это вирусы, которые инфицируют бактерии со специфичностью на уровне видов и штаммов и являются наиболее распространенными биологическими объектами во всех известных экосистемах. В бактериальных сообществах, таких как микробиоты кишечника, фаги участвуют в регулировании динамики популяций микробиоты и стимулируют эволюцию бактерий. В последнее десятилетие возобновился интерес к исследованиям фагов, отчасти из-за специфичной для хозяина способности литических фагов убивать, что является многообещающим инструментом для противодействия растущей угрозе устойчивых к противомикробным препаратам бактерий. Кроме того, недавние исследования, демонстрирующие, что фаги прилипают к кишечной слизи, позволяют предположить, что они могут играть защитную роль в предотвращении бактериальной инвазии в нижележащий эпителий. Важно отметить, что, как и бактериальные микробиомы, нарушенные фагеомы связаны с ухудшением исходов таких заболеваний, как воспалительные заболевания кишечника. Предыдущие исследования показали, что фаги могут модулировать микробиом животных и людей с помощью трансплантации фекальных фильтратов, принося пользу здоровью хозяина. В связи с недавней волной исследований возникла необходимость в разработке и стандартизации протоколов изучения фагов в контексте микробиома кишечника. Данный протокол предусматривает комплекс процедур для изучения изолированных фагов Т4 и их бактериального хозяина, кишечной палочки, в контексте желудочно-кишечного тракта мышей. Методы, описанные здесь, описывают, как начать с лизата фага, ввести его мышам и оценить влияние на бактериальный хозяин и уровни фагов. Этот протокол может быть модифицирован и применен к другим фаго-бактериальным парам и является отправной точкой для изучения динамики хозяин-фаг in vivo.

Introduction

Бактериофаги, или фаги, — это вирусы, которые инфицируют и убивают бактерии со специфичностью на уровне видов и штаммов1. Фаги играют важную роль в сложных бактериальных сообществах, таких как микробиота кишечника, где они участвуют в регулировании динамики популяций и обеспечении приспособленности бактерий2. В течение последнего десятилетия возродился интерес к исследованиям фагов в связи с ростом числа устойчивых к противомикробнымпрепаратам патогенов3 и потенциалом фаговой терапии в качестве альтернативной стратегии лечения. В последние годы коктейли с литическими фагами используются внутривенн....

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями, установленными Комитетом по уходу за животными UBC и протоколами, утвержденными Комитетом по биобезопасности (A23-0113, B19-0038). Мыши были помещены в Университет Британской Колумбии в условиях, свободных от патогенов, в Центре мод?.......

Representative Results

Для изучения взаимодействий между диадой Т4-фаг/E. coli в кишечнике мышей были приготовлены, очищены и очищены Т4-фаг и транспортные лизаты (рис. 1А). Титрование лизатов фагов Т4 проводили методом бляшечного анализа и разбавляли до 2 х 107 КОЕ/мл (2 х 106 КОЕ/мышь) в .......

Discussion

Изучение фагов в микробиоме представляет собой серьезную проблему по сравнению с их бактериальными аналогами. В частности, фаги не содержат консервативного филогенетического маркера, общего для всех фагов, сходного с 16S и 18S рибосомными субъединицами, которые позволяют легко секвенир?.......

Acknowledgements

Авторы признают, что земля, на которой они проводили это исследование, является традиционной, исконной и незаселенной территорией народа xwməθkwəy̓əm (Musqueam). Земля, на которой он расположен, всегда была местом обучения для народа Маскеам, который на протяжении тысячелетий передавал свою культуру, историю и традиции из поколения в поколение на этом месте. Мы призываем других узнать больше о родных землях, в которых они живут и работают в https://native-land.ca. Авторы выражают признательность за поддержку со стороны Совета по естественным наукам и инженерным наукам Канады (NSERC) Canadian Graduate Scholarships - Master's (N.P.), Michael Smith Health Research BC Tra....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-octanol (99%)ThermofisherCAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter UnitsMillipore Sigma SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)Fisher BioReagents BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100Millipore SigmaUFC910008
BD Microtainer® Tubes, SSTBD Medical365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages) Techiplast1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction ModuleBioRad1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)Fisher BioReagentsBP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pkAndwin Scientific 16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)FisherC298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)Crosman Corporation0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)Thermo Scientific 69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)Thermo Scientific K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2OSigma AldrichE7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™ Fisher BioreagentsBP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox Fisher BioreagentsBP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA LadderThermo Scientific SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxnsQuantaBio95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATEDTechiplastUISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrateFisher BioReagentsBP213-1
MaxQ 6000 Incubated ShakerThermo Scientific 8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - LennoxFisher BioReagentsBP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2mlFisher14-666-315
Parafilm sealing filmBemisPM-996
Phage stocksCarolina Biological Supply n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXTLabDiet5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo Scientific A39552S
RNase A (17,500 U)Qiagen19101
RNase-free DNase SetQiagen 79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)Fisher ChemicalBP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)Fisher ChemicalS271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)Fisher scentific n/a
Sterile flexible film isolator Class Biologically Clean n/a
SYBR™ Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102
T100 Thermal Cycler BioRad1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)IDTn/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)IDTn/a
TissueLyser II Qiagen 85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, UltrapureThermo Scientific AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)Fisher BioReagentsBP2484100

References

  1. Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
  2. Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. C....

Explore More Articles

2034

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved