A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
אופטימיזציה של תרבית תאי אפיתל בעדשה הראשית של עכבר: מדריך מקיף לטריפסיניזציה
In This Article
Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול וידאו מפורט לגידול תאי אפיתל ראשוניים של עדשה (LECs), במטרה לשפר את יכולת השחזור ולסייע במחקר בקטרקט ובפסיפיקציה של קפסולה אחורית (PCO). הוא מציע הוראות שלב אחר שלב על דיסקציה של עדשות, בידוד LECs ותיקוף, ומשמש כמדריך רב ערך, במיוחד עבור מצטרפים חדשים בתחום.
Abstract
תאי אפיתל עדשה (LECs) ממלאים תפקידים חשובים רבים בשמירה על ההומאוסטזיס ותפקוד תקין של העדשה. LECs קובעים את צמיחת העדשה, התפתחותה, גודלה ושקיפותה. לעומת זאת, LECs לא מתפקדים יכולים להוביל להיווצרות קטרקט ו opacification קפסולה אחורית (PCO). כתוצאה מכך, הקמת מערכת תרבית LEC ראשונית חזקה חשובה לחוקרים העוסקים בפיתוח עדשות, ביוכימיה, טיפולי קטרקט ומניעת PCO. עם זאת, טיפוח LECs ראשוניים הציב זה מכבר אתגרים בשל זמינותם המוגבלת, קצב ההתרבות האיטי ואופיים העדין.
מחקר זה מתמודד עם מכשולים אלה על ידי הצגת פרוטוקול מקיף לתרבות LEC ראשונית. הפרוטוקול כולל שלבים חיוניים כגון גיבוש מדיום תרבית אופטימלי, בידוד מדויק של קפסולות עדשה, טכניקות טריפסיניזציה, נהלי תת-תרבית, פרוטוקולי קציר והנחיות לאחסון ומשלוח. לאורך כל תהליך התרבית, המורפולוגיה של התא נוטרה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
כדי לאשר את האותנטיות של LECs בתרבית, נערכו בדיקות immunofluorescence כדי לזהות את הנוכחות ואת ההתפלגות התת-תאית של חלבוני עדשה קריטיים, כלומר αA ו-γ-crystallins. פרוטוקול מפורט זה מצייד את החוקרים במשאב רב ערך לטיפוח ואפיון LECs ראשוניים, ומאפשר התקדמות בהבנת הביולוגיה של העדשה ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות להפרעות הקשורות לעדשות.
Introduction
עדשת העין ממלאת תפקיד מכריע בראייה על ידי מיקוד האור הנכנס על הרשתית. הוא מורכב ממבנה שקוף, אווסקולרי המורכב מתאים מיוחדים, ביניהם תאי אפיתל עדשה (LEC) הם שחקני מפתח. LECs ממוקמים על פני השטח הקדמיים של העדשה והם אחראים על שמירה על שקיפותה, ויסות מאזן המים, והשתתפות בצמיחה ופיתוח העדשה 1,2. LECs הם סוג ייחודי של תאים הממוקמים בחלק הקדמי של העדשה, וממלאים תפקיד קריטי בשמירה על בהירות העדשה ותפקודה על ידי ייצור רציף של סיבי העדשה לאורך כל החיים.
קטרקט מאופיין על ידי עכירות מתקדמת של העדשה, וכתוצאה מכך עיוות ופיזור של אור, המוביל ראייה לקויה 3,4
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות האגודה לחקר הראייה והעיניים לשימוש בבעלי חיים בחקר העיניים והראייה. אישור פרוצדורלי ניתן על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות באוניברסיטת צפון טקסס (מספר פרוטוקול: IACUC-2022-0008). עכברי C57BL/6J צעירים, בדרך כלל מתחת לגיל שבועיים,.......
Representative Results
כפי שניתן לראות באיור 2, על-ידי ביצוע פרוטוקול זה, LECs ראשוניים מעכברי C57BL/6J נצמדו לצלחות בתוך פרק זמן של 4 שעות. יש לציין כי נמצאו שרידים גלויים של רקמות אחרות כגון חלקים של הקפסולה האחורית ותאי סיבי העדשה. עם זאת, אלמנטים לא מכוונים אלה לא נצמדו למנה ולכן ניתן היה להסיר אותם על.......
Discussion
הפרוטוקול המוצג במאמר זה מספק מדריך מקיף, שלב אחר שלב, לבידוד, תרבות ותת-תרבות מוצלחים של LECs ראשוניים, יחד עם תיעוד וידאו נלווה. המדריך החזותי המפורט לצד ההוראות הכתובות משפר את הבהירות והנגישות של הפרוטוקול, ומקדם את השימוש בו ואת יכולת השחזור שלו בקרב חוקרים בתחום. המטרה הסופית היא לתרום ?.......
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NEI R21EY033941 (להונגלי וו); משרד ההגנה W81XWH2010896 (להונגלי וו); R15GM123463-02 (לקיילה גרין והונגלי וו)
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
| Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
| Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
| Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
| Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
| DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
| Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
| EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
| Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
| Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
| Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
| PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
| Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
| αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
| γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
References
- Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
- Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. Crystallins and their s....
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved