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Este manuscrito descreve um protocolo de vídeo detalhado para a cultura de células epiteliais primárias do cristalino (LECs), com o objetivo de melhorar a reprodutibilidade e auxiliar a pesquisa em catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Ele oferece instruções passo a passo sobre dissecção de lentes, isolamento de LECs e validação, servindo como um guia valioso, especialmente para recém-chegados no campo.
As células epiteliais do cristalino (LECs) desempenham múltiplos papéis importantes na manutenção da homeostase e da função normal do cristalino. Os LECs determinam o crescimento, o desenvolvimento, o tamanho e a transparência das lentes. Por outro lado, as CLEs disfuncionais podem levar à formação de catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Consequentemente, o estabelecimento de um sistema de cultura LEC primário robusto é importante para pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de lentes, bioquímica, terapêutica de catarata e prevenção de PCO. No entanto, o cultivo de LECs primárias há muito tempo apresenta desafios devido à sua disponibilidade limitada, taxa de proliferação lenta e natureza delicada.
Este estudo aborda esses obstáculos apresentando um protocolo abrangente para cultura LEC primária. O protocolo engloba etapas essenciais, como a formulação de um meio de cultura otimizado, isolamento preciso das cápsulas do cristalino, técnicas de tripsinização, procedimentos de subcultivo, protocolos de colheita e diretrizes para armazenamento e embarque. Durante todo o processo de cultivo, a morfologia celular foi monitorada por meio de microscopia de contraste de fase.
Para confirmar a autenticidade das LECs cultivadas, ensaios de imunofluorescência foram conduzidos para detectar a presença e a distribuição subcelular de proteínas críticas do cristalino, ou seja, αA- e γ-cristalinos. Este protocolo detalhado fornece aos pesquisadores um recurso valioso para cultivar e caracterizar LECs primárias, permitindo avanços em nossa compreensão da biologia do cristalino e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para distúrbios relacionados ao cristalino.
A lente do olho desempenha um papel crucial na visão, concentrando a luz recebida na retina. Consiste em uma estrutura avascular transparente composta por células especializadas, entre as quais as células epiteliais do cristalino (LECs) são peças-chave. As CLEs estão localizadas na superfície anterior do cristalino e são responsáveis por manter sua transparência, regular o balanço hídrico e participar do crescimento e desenvolvimento do cristalino 1,2. LECs são um tipo único de células localizadas na parte anterior da lente, desempenhando um papel crítico na manutenção da clareza e função da lente, produzindo ....
Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. A aprovação do procedimento foi concedida pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte do Texas (número de protocolo: IACUC-2022-0008). Camundongos C57BL/6J jovens, tipicamente com menos de 2 semanas de idade, foram usados nesses estudos.
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Como mostrado na Figura 2, seguindo esse protocolo, LECs primárias de camundongos C57BL/6J aderiram às placas em um período de 4 h. Notadamente, havia resquícios visíveis de outros tecidos, como cortes da cápsula posterior e células de fibras do cristalino. No entanto, esses elementos não intencionais não se prenderam ao prato e, portanto, poderiam ser removidos com a mudança do meio de cultura. Posteriormente, entre o terceiro e o quinto dia, as LECs iniciaram sua fase de prolifer.......
O protocolo apresentado neste artigo fornece um guia passo a passo abrangente para o isolamento, a cultura e a subcultura bem-sucedidos de LECs primários, completo com a documentação em vídeo que o acompanha. O guia visual detalhado, juntamente com as instruções escritas, aumenta a clareza e a acessibilidade do protocolo, promovendo seu uso e reprodutibilidade entre os pesquisadores da área. O objetivo final é contribuir para a expansão do corpo de conhecimento em torno do papel das CELs na formação da catarat.......
Este trabalho foi apoiado pelo NEI R21EY033941 (para Hongli Wu); Departamento de Defesa W81XWH2010896 (para Hongli Wu); R15GM123463-02 (para Kayla Green e Hongli Wu)
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.05% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher | #25300054 | For LECs dissociation |
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody | Jackson ImmunoResearch | #715-545-150 | For cell validation |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-605-003 | For cell validation |
Antibody dilution buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
Beaver safety knife | Beaver-Visitec International | #3782235 | For lens dissection |
Blocking buffer | Licor | #927-60001 | For cell validation |
Capsulorhexis forceps | Titan Medical Instruments | TMF-124 | For lens capsule isolation |
DMEM | Sigma Aldrich | D6429 | For LECs culture medium |
DMSO | Sigma Aldrich | #D2650 | For making freezing medium |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | #J67802 | For lens dissection |
Dumont tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | For lens capsule isolation |
EpiCGS-a (optional) | ScienCell | 4182 | For LECs culture medium |
FBS | Sigma Aldrich | F2442 | For LECs culture medium |
Gentamicin (50 mg/mL) | Sigma-Aldrich | G1397 | For LECs culture medium |
Hoechst 33342 solution | Thermo Fisher | #62249 | For cell validation |
Micro-dissecting scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5983 | For lens dissection |
Micro-dissecting tweezers | Roboz Surgical Instrument | RS5137 | For lens dissection |
PROX1 antibody | Thermo Fisher | 11067-2-AP | For cell validation |
Vannas micro-dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5608 | For lens capsule isolation |
αA-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-28306 | For cell validation |
γ-crystallin antibody | Santa Cruz | sc-365256 | For cell validation |
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