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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo de vídeo detalhado para a cultura de células epiteliais primárias do cristalino (LECs), com o objetivo de melhorar a reprodutibilidade e auxiliar a pesquisa em catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Ele oferece instruções passo a passo sobre dissecção de lentes, isolamento de LECs e validação, servindo como um guia valioso, especialmente para recém-chegados no campo.

Abstract

As células epiteliais do cristalino (LECs) desempenham múltiplos papéis importantes na manutenção da homeostase e da função normal do cristalino. Os LECs determinam o crescimento, o desenvolvimento, o tamanho e a transparência das lentes. Por outro lado, as CLEs disfuncionais podem levar à formação de catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Consequentemente, o estabelecimento de um sistema de cultura LEC primário robusto é importante para pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de lentes, bioquímica, terapêutica de catarata e prevenção de PCO. No entanto, o cultivo de LECs primárias há muito tempo apresenta desafios devido à sua disponibilidade limitada, taxa de proliferação lenta e natureza delicada.

Este estudo aborda esses obstáculos apresentando um protocolo abrangente para cultura LEC primária. O protocolo engloba etapas essenciais, como a formulação de um meio de cultura otimizado, isolamento preciso das cápsulas do cristalino, técnicas de tripsinização, procedimentos de subcultivo, protocolos de colheita e diretrizes para armazenamento e embarque. Durante todo o processo de cultivo, a morfologia celular foi monitorada por meio de microscopia de contraste de fase.

Para confirmar a autenticidade das LECs cultivadas, ensaios de imunofluorescência foram conduzidos para detectar a presença e a distribuição subcelular de proteínas críticas do cristalino, ou seja, αA- e γ-cristalinos. Este protocolo detalhado fornece aos pesquisadores um recurso valioso para cultivar e caracterizar LECs primárias, permitindo avanços em nossa compreensão da biologia do cristalino e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para distúrbios relacionados ao cristalino.

Introduction

A lente do olho desempenha um papel crucial na visão, concentrando a luz recebida na retina. Consiste em uma estrutura avascular transparente composta por células especializadas, entre as quais as células epiteliais do cristalino (LECs) são peças-chave. As CLEs estão localizadas na superfície anterior do cristalino e são responsáveis por manter sua transparência, regular o balanço hídrico e participar do crescimento e desenvolvimento do cristalino 1,2. LECs são um tipo único de células localizadas na parte anterior da lente, desempenhando um papel crítico na manutenção da clareza e função da lente, produzindo ....

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. A aprovação do procedimento foi concedida pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte do Texas (número de protocolo: IACUC-2022-0008). Camundongos C57BL/6J jovens, tipicamente com menos de 2 semanas de idade, foram usados nesses estudos.

1........

Representative Results

Como mostrado na Figura 2, seguindo esse protocolo, LECs primárias de camundongos C57BL/6J aderiram às placas em um período de 4 h. Notadamente, havia resquícios visíveis de outros tecidos, como cortes da cápsula posterior e células de fibras do cristalino. No entanto, esses elementos não intencionais não se prenderam ao prato e, portanto, poderiam ser removidos com a mudança do meio de cultura. Posteriormente, entre o terceiro e o quinto dia, as LECs iniciaram sua fase de prolifer.......

Discussion

O protocolo apresentado neste artigo fornece um guia passo a passo abrangente para o isolamento, a cultura e a subcultura bem-sucedidos de LECs primários, completo com a documentação em vídeo que o acompanha. O guia visual detalhado, juntamente com as instruções escritas, aumenta a clareza e a acessibilidade do protocolo, promovendo seu uso e reprodutibilidade entre os pesquisadores da área. O objetivo final é contribuir para a expansão do corpo de conhecimento em torno do papel das CELs na formação da catarat.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo NEI R21EY033941 (para Hongli Wu); Departamento de Defesa W81XWH2010896 (para Hongli Wu); R15GM123463-02 (para Kayla Green e Hongli Wu)

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher#25300054For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody Jackson ImmunoResearch#715-545-150For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003For cell validation
Antibody dilution bufferLicor#927-60001For cell validation
Beaver safety knifeBeaver-Visitec International#3782235For lens dissection
Blocking bufferLicor#927-60001For cell validation
Capsulorhexis forcepsTitan Medical InstrumentsTMF-124For lens capsule isolation
DMEMSigma AldrichD6429For LECs culture medium
DMSOSigma Aldrich#D2650For making freezing medium 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher#J67802For lens dissection
Dumont tweezersRoboz Surgical InstrumentRS-4976For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)ScienCell4182For LECs culture medium
FBSSigma AldrichF2442For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)Sigma-AldrichG1397For LECs culture medium
Hoechst 33342 solutionThermo Fisher#62249For cell validation
Micro-dissecting scissorsRoboz Surgical Instrument RS-5983For lens dissection
Micro-dissecting tweezersRoboz Surgical Instrument RS5137 For lens dissection
PROX1 antibodyThermo Fisher11067-2-APFor cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissorsRoboz Surgical InstrumentRS-5608For lens capsule isolation
αA-crystallin antibodySanta Cruzsc-28306For cell validation 
γ-crystallin antibodySanta Cruzsc-365256For cell validation

References

  1. Bermbach, G., Mayer, U., Naumann, G. O. Human lens epithelial cells in tissue culture. Experimental Eye Research. 52 (2), 113-119 (1991).
  2. Reddy, V. N., Lin, L. R., Arita, T., Zigler, J. S., Huang, Q. L. Crystallins and their s....

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