Otimizando a cultura de células epiteliais primárias de lente de camundongo: um guia abrangente para tripsinização

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo de vídeo detalhado para a cultura de células epiteliais primárias do cristalino (LECs), com o objetivo de melhorar a reprodutibilidade e auxiliar a pesquisa em catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Ele oferece instruções passo a passo sobre dissecção de lentes, isolamento de LECs e validação, servindo como um guia valioso, especialmente para recém-chegados no campo.

Abstract

As células epiteliais do cristalino (LECs) desempenham múltiplos papéis importantes na manutenção da homeostase e da função normal do cristalino. Os LECs determinam o crescimento, o desenvolvimento, o tamanho e a transparência das lentes. Por outro lado, as CLEs disfuncionais podem levar à formação de catarata e opacificação da cápsula posterior (PCO). Consequentemente, o estabelecimento de um sistema de cultura LEC primário robusto é importante para pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de lentes, bioquímica, terapêutica de catarata e prevenção de PCO. No entanto, o cultivo de LECs primárias há muito tempo apresenta desafios devido à sua disponibilidade limitada, taxa de proliferação lenta e natureza delicada.

Este estudo aborda esses obstáculos apresentando um protocolo abrangente para cultura LEC primária. O protocolo engloba etapas essenciais, como a formulação de um meio de cultura otimizado, isolamento preciso das cápsulas do cristalino, técnicas de tripsinização, procedimentos de subcultivo, protocolos de colheita e diretrizes para armazenamento e embarque. Durante todo o processo de cultivo, a morfologia celular foi monitorada por meio de microscopia de contraste de fase.

Para confirmar a autenticidade das LECs cultivadas, ensaios de imunofluorescência foram conduzidos para detectar a presença e a distribuição subcelular de proteínas críticas do cristalino, ou seja, αA- e γ-cristalinos. Este protocolo detalhado fornece aos pesquisadores um recurso valioso para cultivar e caracterizar LECs primárias, permitindo avanços em nossa compreensão da biologia do cristalino e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para distúrbios relacionados ao cristalino.

Introduction

A lente do olho desempenha um papel crucial na visão, concentrando a luz recebida na retina. Consiste em uma estrutura avascular transparente composta por células especializadas, entre as quais as células epiteliais do cristalino (LECs) são peças-chave. As CLEs estão localizadas na superfície anterior do cristalino e são responsáveis por manter sua transparência, regular o balanço hídrico e participar do crescimento e desenvolvimento do cristalino ^1,2. LECs são um tipo único de células localizadas na parte anterior da lente, desempenhando um papel crítico na manutenção da clareza e função da lente, produzindo ....

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. A aprovação do procedimento foi concedida pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Norte do Texas (número de protocolo: IACUC-2022-0008). Camundongos C57BL/6J jovens, tipicamente com menos de 2 semanas de idade, foram usados nesses estudos.

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Discussion

O protocolo apresentado neste artigo fornece um guia passo a passo abrangente para o isolamento, a cultura e a subcultura bem-sucedidos de LECs primários, completo com a documentação em vídeo que o acompanha. O guia visual detalhado, juntamente com as instruções escritas, aumenta a clareza e a acessibilidade do protocolo, promovendo seu uso e reprodutibilidade entre os pesquisadores da área. O objetivo final é contribuir para a expansão do corpo de conhecimento em torno do papel das CELs na formação da catarat.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA	Thermo Fisher	#25300054	For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody	Jackson ImmunoResearch	#715-545-150	For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-605-003	For cell validation
Antibody dilution buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Beaver safety knife	Beaver-Visitec International	#3782235	For lens dissection
Blocking buffer	Licor	#927-60001	For cell validation
Capsulorhexis forceps	Titan Medical Instruments	TMF-124	For lens capsule isolation
DMEM	Sigma Aldrich	D6429	For LECs culture medium
DMSO	Sigma Aldrich	#D2650	For making freezing medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	#J67802	For lens dissection
Dumont tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS-4976	For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)	ScienCell	4182	For LECs culture medium
FBS	Sigma Aldrich	F2442	For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)	Sigma-Aldrich	G1397	For LECs culture medium
Hoechst 33342 solution	Thermo Fisher	#62249	For cell validation
Micro-dissecting scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5983	For lens dissection
Micro-dissecting tweezers	Roboz Surgical Instrument	RS5137	For lens dissection
PROX1 antibody	Thermo Fisher	11067-2-AP	For cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5608	For lens capsule isolation
αA-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-28306	For cell validation
γ-crystallin antibody	Santa Cruz	sc-365256	For cell validation