שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

Summary

למחסום הדם-מוח (BBB) יש תפקיד מכריע בשמירה על סביבת מוח יציבה ובריאה. תפקוד לקוי של BBB קשור למחלות נוירולוגיות רבות. פיתחנו מודל תלת-ממדי, הנגזר מתאי גזע של BBB כדי לחקור פתולוגיה של כלי דם במוח, שלמות BBB, וכיצד BBB משתנה על ידי גנטיקה ומחלות.

Abstract

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מרכיב פיזיולוגי מרכזי במערכת העצבים המרכזית (CNS), השומר על חומרי מזון, מפנה פסולת ומגן על המוח מפני פתוגנים. תכונות המחסום הטבועות ב- BBB מציבות אתגר להעברת תרופות טיפוליות למערכת העצבים המרכזית לטיפול במחלות נוירולוגיות. תפקוד לקוי של BBB נקשר למחלות נוירולוגיות. אנגיופתיה עמילואידית מוחית (CAA), שקיעת עמילואיד בכלי הדם במוח המובילה לפגיעה ב-BBB, היא תחלואה נלווית ברוב המקרים של מחלת אלצהיימר (AD), דבר המצביע על כך שתפקוד לקוי או פירוק של BBB עשויים להיות מעורבים בניוון עצבי. בשל גישה מוגבלת לרקמת BBB אנושית, המנגנונים התורמים לתפקוד תקין של BBB וניוון BBB נותרים בלתי ידועים. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, פיתחנו BBB שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (iBBB) על ידי שילוב תאי אנדותל, פריציטים ואסטרוציטים במטריצה תלת-ממדית. iBBB מתכנס בעצמו כדי לשחזר את האנטומיה ואת האינטראקציות התאיות הקיימות ב- BBB. זריעת iBBBs עם עמילואיד לוכדת היבטים מרכזיים של CAA. בנוסף, iBBB מציע פלטפורמה גמישה לווסת גורמים גנטיים וסביבתיים המעורבים במחלות כלי דם במוח וניוון עצבי, כדי לחקור כיצד גנטיקה ואורח חיים משפיעים על הסיכון למחלות. לבסוף, iBBB יכול לשמש להקרנת תרופות ומחקרי כימיה תרופתית כדי לייעל את המסירה הטיפולית למערכת העצבים המרכזית. בפרוטוקול זה אנו מתארים את ההתמיינות של שלושת סוגי התאים (תאי אנדותל, פריציטים ואסטרוציטים) הנובעים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, כיצד להרכיב את התאים המתמיינים לתוך iBBB, וכיצד למדל CAA במבחנה באמצעות עמילואיד אקסוגני. מודל זה מתגבר על האתגר של חקר רקמת מוח אנושית חיה באמצעות מערכת שיש לה גם נאמנות ביולוגית וגם גמישות ניסויית, ומאפשר לחקור את מחסום הדם-מוח האנושי ואת תפקידו בניוון עצבי.

Introduction

מחסום הדם-מוח (BBB) הוא רשת כלי דם מרכזית המפרידה בין מערכת העצבים המרכזית (CNS) לפריפריה כדי לשמור על סביבה אידיאלית לתפקוד עצבי תקין. יש לו תפקיד קריטי בוויסות הזרימה והזרימה של חומרים למערכת העצבים המרכזית על ידי שמירה על הומאוסטזיס מטבולי 1,2,3,4, פינוי פסולת ^4,5,6, והגנה על המוח מפני פתוגנים ורעלים ^7,8.

סוג התא העיקרי של BBB הוא תא אנדותל (EC). תאי אנדותל, שמ....

Protocol

1. התמיינות iPSCs לתאי iBBB

הערה: פרוטוקולי בידול אלה תוארו בעבר ב- Mesentier-Louro et ^al.34.

1. ציפוי לוחות תרבית תאים
   1. הפשרה מטריצת קרום גורם גדילה מופחת (GF) למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס. לדלל 500 μL של מטריצת קרום מרתף ב 49.5 מ"ל של DMEM. שמור על תמיסה זו קרה כדי למנוע פיל?.......

Discussion

תפקוד לקוי של BBB הוא תחלואה משותפת, ופוטנציאלית, גורם או גורם מחמיר במחלות נוירולוגיות רבות ^7,40,41. עם זאת, זה כמעט בלתי אפשרי לחקור את הביולוגיה המולקולרית והתאית העומדת בבסיס תפקוד לקוי והתמוטטות של BBB בבני אדם עם מחלות נוירו-וסקולריות. ה- in.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6e10 amyloid-β antibody	Biolegend	SIG-39320	Used at 1:1000
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Activin A	Peprotech	20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies	Invitrogen	Various	Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril	AnaSpec	AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril	AnaSpec	AS-20276
Aquaporin-4 antibody	Invitrogen	PA5-53234	Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements	ScienCell	1801
B-27 serum-free supplement	Gibco	17504044
BMP4	Peprotech	120-05ET
CHIR99021	Cyamn Chemical	13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium	Gibco	10565018
Doxycycline	Millipore-Sigma	D3072-1ML
FGF-basic	Peprotech	100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium	VWR	100502-406
Forskolin	R&D Systems	1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement	Gibco	A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes	Mattek Corporation	P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement	Gibco	35050061
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Human Endothelial Serum-free medium	Gibco	11111044
LDN193189	Tocris	6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)	Gibco	11140050
N-2 supplement	Gibco	17502048
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Millipore-Sigma	S30-100mL	Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher	28908
PDGF-BB	Peprotech	100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody	R&D Systems	AF385	Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Gibco	10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody	R&D Systems	AF806	Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)	AddGene	Catalog #168805
S100B antibody	Sigma-Aldrich	S2532-100uL	Used at 1:500
SB43152	Reprocell	04-0010
Thioflavin T	Chem Impex	22870	Used at 25uM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody	R&D systems	AF938	Used at 1:500
VEGF-A	Peprotech	100-20
Y27632	R&D Systems	1254/10
ZO-1	Invitrogen	MA3-39100-A488	Dilution = 1:500