Reconstrução da Barreira Hematoencefálica In Vitro para Modelar e Combater Terapeuticamente a Doença Neurológica

Summary

A barreira hematoencefálica (BHE) tem um papel crucial na manutenção de um ambiente cerebral estável e saudável. A disfunção da BHE está associada a muitas doenças neurológicas. Desenvolvemos um modelo 3D, derivado de células-tronco do BBB para investigar a patologia cerebrovascular, a integridade do BBB e como o BBB é alterado pela genética e pela doença.

Abstract

A barreira hematoencefálica (BHE) é um componente fisiológico chave do sistema nervoso central (SNC), mantendo nutrientes, limpando resíduos e protegendo o cérebro de patógenos. As propriedades de barreira inerentes à BHE representam um desafio para a liberação de fármacos terapêuticos no SNC para o tratamento de doenças neurológicas. A função BBB prejudicada tem sido relacionada à doença neurológica. A angiopatia amiloide cerebral (AAC), a deposição de amiloide na vasculatura cerebral levando a um comprometimento da BHE, é uma comorbidade na maioria dos casos de doença de Alzheimer (DA), sugerindo que a disfunção ou colapso da BHE pode estar envolvida na neurodegeneração. Devido ao acesso limitado ao tecido BBB humano, os mecanismos que contribuem para a função adequada da BBB e degeneração da BBB permanecem desconhecidos. Para resolver essas limitações, desenvolvemos uma BBB derivada de células-tronco pluripotentes humanas (iBBB) incorporando células endoteliais, pericitos e astrócitos em uma matriz 3D. O iBBB se auto-monta para recapitular a anatomia e as interações celulares presentes no BBB. A semeadura de iBBBs com amiloide captura os principais aspectos do CAA. Além disso, o iBBB oferece uma plataforma flexível para modular fatores genéticos e ambientais implicados na doença cerebrovascular e neurodegeneração, para investigar como a genética e o estilo de vida afetam o risco de doenças. Finalmente, o iBBB pode ser usado para triagem de drogas e estudos de química medicinal para otimizar a entrega terapêutica ao SNC. Neste protocolo, descrevemos a diferenciação dos três tipos de células (células endoteliais, pericitos e astrócitos) oriundas de células-tronco pluripotentes humanas, como montar as células diferenciadas no iBBB e como modelar CAA in vitro usando amiloide exógeno. Este modelo supera o desafio de estudar o tecido cerebral humano vivo com um sistema que tem fidelidade biológica e flexibilidade experimental, e permite a interrogação do BBB humano e seu papel na neurodegeneração.

Introduction

A barreira hematoencefálica (BHE) é uma rede microvascular chave que separa o sistema nervoso central (SNC) da periferia para manter um ambiente ideal para a função neuronal adequada. Tem papel fundamental na regulação do influxo e efluxo de substâncias para o SNC, mantendo a homeostase metabólica 1,2,3,4, eliminando resíduos ^4,5,6 e protegendo o cérebro de patógenos e toxinas ^7,8.

Protocol

1. Diferenciando iPSCs em células iBBB

NOTA: Estes protocolos de diferenciação foram previamente descritos em Mesentier-Louro et ^al.34.

1. Revestimento de placas de cultura celular
   1. Descongelar a matriz de membrana do fator de crescimento reduzido (GF) durante a noite a 4 °C. Diluir 500 μL de matriz da membrana basal em 49,5 mL de DMEM. Manter esta solução fria para evitar a polimerização prematura da solução de revestimento.

Discussion

A disfunção da BHE é uma comorbidade e, potencialmente, causa ou fator de exacerbação de inúmeras doenças neurológicas ^7,40,41. No entanto, é quase impossível estudar a biologia molecular e celular subjacente à disfunção e degradação da BBB em humanos com doença neurovascular. O BBB induzível (iBBB) apresentado neste protocolo fornece um sistema in vitro que recapitula interações celulares importantes.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6e10 amyloid-β antibody	Biolegend	SIG-39320	Used at 1:1000
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104
Activin A	Peprotech	20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies	Invitrogen	Various	Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril	AnaSpec	AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril	AnaSpec	AS-20276
Aquaporin-4 antibody	Invitrogen	PA5-53234	Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements	ScienCell	1801
B-27 serum-free supplement	Gibco	17504044
BMP4	Peprotech	120-05ET
CHIR99021	Cyamn Chemical	13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium	Gibco	10565018
Doxycycline	Millipore-Sigma	D3072-1ML
FGF-basic	Peprotech	100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium	VWR	100502-406
Forskolin	R&D Systems	1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement	Gibco	A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes	Mattek Corporation	P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement	Gibco	35050061
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Human Endothelial Serum-free medium	Gibco	11111044
LDN193189	Tocris	6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)	Gibco	11140050
N-2 supplement	Gibco	17502048
Neurobasal medium	Gibco	21103049
Normal Donkey Serum	Millipore-Sigma	S30-100mL	Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher	28908
PDGF-BB	Peprotech	100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody	R&D Systems	AF385	Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4	Gibco	10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody	R&D Systems	AF806	Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)	AddGene	Catalog #168805
S100B antibody	Sigma-Aldrich	S2532-100uL	Used at 1:500
SB43152	Reprocell	04-0010
Thioflavin T	Chem Impex	22870	Used at 25uM
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody	R&D systems	AF938	Used at 1:500
VEGF-A	Peprotech	100-20
Y27632	R&D Systems	1254/10
ZO-1	Invitrogen	MA3-39100-A488	Dilution = 1:500