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* These authors contributed equally
A barreira hematoencefálica (BHE) tem um papel crucial na manutenção de um ambiente cerebral estável e saudável. A disfunção da BHE está associada a muitas doenças neurológicas. Desenvolvemos um modelo 3D, derivado de células-tronco do BBB para investigar a patologia cerebrovascular, a integridade do BBB e como o BBB é alterado pela genética e pela doença.
A barreira hematoencefálica (BHE) é um componente fisiológico chave do sistema nervoso central (SNC), mantendo nutrientes, limpando resíduos e protegendo o cérebro de patógenos. As propriedades de barreira inerentes à BHE representam um desafio para a liberação de fármacos terapêuticos no SNC para o tratamento de doenças neurológicas. A função BBB prejudicada tem sido relacionada à doença neurológica. A angiopatia amiloide cerebral (AAC), a deposição de amiloide na vasculatura cerebral levando a um comprometimento da BHE, é uma comorbidade na maioria dos casos de doença de Alzheimer (DA), sugerindo que a disfunção ou colapso da BHE pode estar envolvida na neurodegeneração. Devido ao acesso limitado ao tecido BBB humano, os mecanismos que contribuem para a função adequada da BBB e degeneração da BBB permanecem desconhecidos. Para resolver essas limitações, desenvolvemos uma BBB derivada de células-tronco pluripotentes humanas (iBBB) incorporando células endoteliais, pericitos e astrócitos em uma matriz 3D. O iBBB se auto-monta para recapitular a anatomia e as interações celulares presentes no BBB. A semeadura de iBBBs com amiloide captura os principais aspectos do CAA. Além disso, o iBBB oferece uma plataforma flexível para modular fatores genéticos e ambientais implicados na doença cerebrovascular e neurodegeneração, para investigar como a genética e o estilo de vida afetam o risco de doenças. Finalmente, o iBBB pode ser usado para triagem de drogas e estudos de química medicinal para otimizar a entrega terapêutica ao SNC. Neste protocolo, descrevemos a diferenciação dos três tipos de células (células endoteliais, pericitos e astrócitos) oriundas de células-tronco pluripotentes humanas, como montar as células diferenciadas no iBBB e como modelar CAA in vitro usando amiloide exógeno. Este modelo supera o desafio de estudar o tecido cerebral humano vivo com um sistema que tem fidelidade biológica e flexibilidade experimental, e permite a interrogação do BBB humano e seu papel na neurodegeneração.
A barreira hematoencefálica (BHE) é uma rede microvascular chave que separa o sistema nervoso central (SNC) da periferia para manter um ambiente ideal para a função neuronal adequada. Tem papel fundamental na regulação do influxo e efluxo de substâncias para o SNC, mantendo a homeostase metabólica 1,2,3,4, eliminando resíduos 4,5,6 e protegendo o cérebro de patógenos e toxinas 7,8.
1. Diferenciando iPSCs em células iBBB
NOTA: Estes protocolos de diferenciação foram previamente descritos em Mesentier-Louro et al.34.
Um iBBB devidamente formado solidifica-se em um único disco translúcido (Figura 3A). É normal que o iBBB se desprenda da superfície em que foi pipetado pela primeira vez após alguns dias. Isso não pode ser evitado, mas não é uma grande preocupação para a formação adequada do iBBB se for tomado cuidado ao trocar de mídia para não aspirar acidentalmente o iBBB. Após 24 h, células únicas uniformemente distribuídas podem ser identificadas ao microscópio de campo claro (
A disfunção da BHE é uma comorbidade e, potencialmente, causa ou fator de exacerbação de inúmeras doenças neurológicas 7,40,41. No entanto, é quase impossível estudar a biologia molecular e celular subjacente à disfunção e degradação da BBB em humanos com doença neurovascular. O BBB induzível (iBBB) apresentado neste protocolo fornece um sistema in vitro que recapitula interações celulares importantes.......
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Este trabalho é apoiado pelo NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer's Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation e Brain Injury Association of America. C.G. é suportado pelo NIH F31NS130909. A Figura 1A foi criada com BioRender.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
6e10 amyloid-β antibody | Biolegend | SIG-39320 | Used at 1:1000 |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
Activin A | Peprotech | 20-14E | |
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies | Invitrogen | Various | Used at 1:1000 |
Amyloid-beta 40 fibril | AnaSpec | AS-24235 | |
Amyloid-beta 42 fibril | AnaSpec | AS-20276 | |
Aquaporin-4 antibody | Invitrogen | PA5-53234 | Used at 1:300 |
Astrocyte basal media and supplements | ScienCell | 1801 | |
B-27 serum-free supplement | Gibco | 17504044 | |
BMP4 | Peprotech | 120-05ET | |
CHIR99021 | Cyamn Chemical | 13112 | |
DMEM/F12 with GlutaMAX medium | Gibco | 10565018 | |
Doxycycline | Millipore-Sigma | D3072-1ML | |
FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
Fluoromount-G slide mounting medium | VWR | 100502-406 | |
Forskolin | R&D Systems | 1099/10 | |
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement | Gibco | A1413302 | |
Glass Bottom 48-well Culture Dishes | Mattek Corporation | P48G-1.5-6-F | |
GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
Human Endothelial Serum-free medium | Gibco | 11111044 | |
LDN193189 | Tocris | 6053 | |
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA) | Gibco | 11140050 | |
N-2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
Normal Donkey Serum | Millipore-Sigma | S30-100mL | Use serum to match secondary antibody host |
Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher | 28908 | |
PDGF-BB | Peprotech | 100-14B | |
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody | R&D Systems | AF385 | Used at 1:500 |
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010031 | |
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody | R&D Systems | AF806 | Used at 1:500 |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) | AddGene | Catalog #168805 | |
S100B antibody | Sigma-Aldrich | S2532-100uL | Used at 1:500 |
SB43152 | Reprocell | 04-0010 | |
Thioflavin T | Chem Impex | 22870 | Used at 25uM |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250mL | |
VE-cadherin (CD144) antibody | R&D systems | AF938 | Used at 1:500 |
VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
Y27632 | R&D Systems | 1254/10 | |
ZO-1 | Invitrogen | MA3-39100-A488 | Dilution = 1:500 |
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