A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Этот протокол описывает рабочий процесс от культивирования клеток ex vivo или in vitro до предварительной обработки транскриптомных данных для экономически эффективного скрининга лекарств на основе транскриптома.
Транскриптомика позволяет получить всестороннее представление о клеточных программах и их реакциях на возмущения. Несмотря на значительное снижение затрат на библиотечное производство и секвенирование в последнее десятилетие, применение этих технологий в масштабах, необходимых для скрининга лекарств, остается непомерно дорогим, что препятствует огромному потенциалу этих методов. В нашем исследовании представлена экономически эффективная система скрининга лекарственных средств на основе транскриптома, сочетающая миниатюрные культуры возмущений с мини-объемной транскриптомикой. Оптимизированный протокол mini-bulk обеспечивает информативные биологические сигналы на экономически эффективной глубине секвенирования, что позволяет проводить обширный скрининг известных лекарств и новых молекул. В зависимости от выбранного лечения и инкубационного времени, этот протокол приведет к секвенированию библиотек в течение примерно 2 дней. Благодаря наличию нескольких остановочных точек в рамках этого протокола, подготовка библиотеки, а также секвенирование могут выполняться независимо от времени. Возможна одновременная обработка большого количества образцов; Измерение до 384 образцов было проведено без потери качества данных. Также не существует известных ограничений по количеству состояний и/или препаратов, несмотря на вариабельность оптимальных сроков инкубации лекарств.
Разработка новых лекарственных средств представляет собой сложный и трудоемкий процесс, который включает в себя идентификацию потенциальных лекарственных средств и их мишеней, оптимизацию и синтез лекарственных препаратов-кандидатов, а также проверку их эффективности и безопасности в доклинических иклинических испытаниях1. Традиционные методы скрининга лекарственных средств, т.е. систематическая оценка библиотек соединений-кандидатов для терапевтических целей, предполагают использование животных моделей или клеточных анализов для проверки воздействия на конкретные мишени или пути. Несмотря на то, что эти методы были успешны в выявлении лекарств....
Этот протокол соответствует рекомендациям местных комитетов по этике Боннского университета.
1. Приготовление буферов, растворов и оборудования
В соответствии с описанным протоколом ПБМК человека высевали, обрабатывали различными иммуномодулирующими препаратами и после разного инкубационного периода собирали для массового транскриптомного анализа с использованием протокола секвенирования (рис. 1).
Открытие и разработка лекарств могут значительно выиграть от целостного взгляда на клеточные процессы, который может обеспечить массовая транскриптомика. Тем не менее, этот подход часто ограничен высокой стоимостью эксперимента со стандартным протоколом массового секвенирования РН.......
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
J.L.S. поддерживается Немецким научно-исследовательским обществом (DFG) в рамках Стратегии совершенствования Германии (EXC2151-390873048), а также в соответствии с SCHU 950/8-1; ГРК 2168, ТП11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, финансируемый BMBF проект передового опыта «Диета-Тело-Мозг» (DietBB); и проект ЕС SYSCID по гранту No 733100. М.Б. поддерживается DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. поддерживается DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - номер проекта 513977171) и Стратегией превосходства Германии (EXC2151-390873048). Изображения, созданные с помощью BioRender.com.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 | |
Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G | |
Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved