Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол описывает рабочий процесс от культивирования клеток ex vivo или in vitro до предварительной обработки транскриптомных данных для экономически эффективного скрининга лекарств на основе транскриптома.

Abstract

Транскриптомика позволяет получить всестороннее представление о клеточных программах и их реакциях на возмущения. Несмотря на значительное снижение затрат на библиотечное производство и секвенирование в последнее десятилетие, применение этих технологий в масштабах, необходимых для скрининга лекарств, остается непомерно дорогим, что препятствует огромному потенциалу этих методов. В нашем исследовании представлена экономически эффективная система скрининга лекарственных средств на основе транскриптома, сочетающая миниатюрные культуры возмущений с мини-объемной транскриптомикой. Оптимизированный протокол mini-bulk обеспечивает информативные биологические сигналы на экономически эффективной глубине секвенирования, что позволяет проводить обширный скрининг известных лекарств и новых молекул. В зависимости от выбранного лечения и инкубационного времени, этот протокол приведет к секвенированию библиотек в течение примерно 2 дней. Благодаря наличию нескольких остановочных точек в рамках этого протокола, подготовка библиотеки, а также секвенирование могут выполняться независимо от времени. Возможна одновременная обработка большого количества образцов; Измерение до 384 образцов было проведено без потери качества данных. Также не существует известных ограничений по количеству состояний и/или препаратов, несмотря на вариабельность оптимальных сроков инкубации лекарств.

Introduction

Разработка новых лекарственных средств представляет собой сложный и трудоемкий процесс, который включает в себя идентификацию потенциальных лекарственных средств и их мишеней, оптимизацию и синтез лекарственных препаратов-кандидатов, а также проверку их эффективности и безопасности в доклинических иклинических испытаниях1. Традиционные методы скрининга лекарственных средств, т.е. систематическая оценка библиотек соединений-кандидатов для терапевтических целей, предполагают использование животных моделей или клеточных анализов для проверки воздействия на конкретные мишени или пути. Несмотря на то, что эти методы были успешны в выявлении лекарств....

Protocol

Этот протокол соответствует рекомендациям местных комитетов по этике Боннского университета.

1. Приготовление буферов, растворов и оборудования

  1. Приготовьте растворы и соберите материалы, описанные в Таблице материалов.
  2. Водяную баню нагрет?.......

Representative Results

В соответствии с описанным протоколом ПБМК человека высевали, обрабатывали различными иммуномодулирующими препаратами и после разного инкубационного периода собирали для массового транскриптомного анализа с использованием протокола секвенирования (рис. 1).

Discussion

Открытие и разработка лекарств могут значительно выиграть от целостного взгляда на клеточные процессы, который может обеспечить массовая транскриптомика. Тем не менее, этот подход часто ограничен высокой стоимостью эксперимента со стандартным протоколом массового секвенирования РН.......

Acknowledgements

J.L.S. поддерживается Немецким научно-исследовательским обществом (DFG) в рамках Стратегии совершенствования Германии (EXC2151-390873048), а также в соответствии с SCHU 950/8-1; ГРК 2168, ТП11; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, финансируемый BMBF проект передового опыта «Диета-Тело-Мозг» (DietBB); и проект ЕС SYSCID по гранту No 733100. М.Б. поддерживается DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. поддерживается DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - номер проекта 513977171) и Стратегией превосходства Германии (EXC2151-390873048). Изображения, созданные с помощью BioRender.com.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL conical tubefisher scientific10203001
Adhesive PCR Plate SealsThermo Fisher ScientificAB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)IlluminaFC-131-1096Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beadsBeckman CoulterA 63881
Betaine Sigma-Aldrich61962
Cell culture grade 96-well platesThermo Fisher Scientific260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)Integra Bioscience158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM eachFermentasR0192
DMSOSigma-Aldrich276855
DTT (100 mM)Invitrogen18064-014
EDTASigma-Aldrich798681for adherent cells
EthanolSigma-Aldrich51976
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific26140079
Filter tips (10 µL)Gilson F171203
Filter tips (100 µL)Gilson F171403
Filter tips (20 µL)Gilson F171303
Filter tips (200 µL)Gilson F171503
Guanidine HydrochlorideSigma-AldrichG3272
ISPCR primer (10 µM)Biomers.net GmbHSP100065′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)KAPA BiosystemsKK2601
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-AldrichM8266
Magnetic stand 96AmbionAM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer IlluminaFC-131-1096Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primerIllumina
Nuclease-free waterInvitrogen10977049
PBSThermo Fisher ScientificAM9624
PCR 96-well platesThermo Fisher ScientificAB0600
PCR plate sealerThermo Fisher ScientificHSF0031
Penicillin / Streptomycin Thermo Fisher Scientific15070063
Qubit 4 fluorometerInvitrogen15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)TAKARA2313A
RPMI-1640 cell culture medium Gibco61870036If not working with PBMCs, adjust to cell type 
SMART dT30VN primerSigma-Aldrich5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACT30VN-3
Standard lab equipmentvariousvariouse.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)Thermo Fisher Scientific18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)Thermo Fisher Scientific18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)IlluminaFC-131-1096Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200AgilentG2991BA
Thermocycler (S1000)Bio-Rad1852148
TSO-LNA (100 uM)Eurogentec5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 MixerSigma-AldrichZ258415

References

  1. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  2. Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery.

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved