Экономичный транскриптомный скрининг лекарственных препаратов

Summary

Этот протокол описывает рабочий процесс от культивирования клеток ex vivo или in vitro до предварительной обработки транскриптомных данных для экономически эффективного скрининга лекарств на основе транскриптома.

Abstract

Транскриптомика позволяет получить всестороннее представление о клеточных программах и их реакциях на возмущения. Несмотря на значительное снижение затрат на библиотечное производство и секвенирование в последнее десятилетие, применение этих технологий в масштабах, необходимых для скрининга лекарств, остается непомерно дорогим, что препятствует огромному потенциалу этих методов. В нашем исследовании представлена экономически эффективная система скрининга лекарственных средств на основе транскриптома, сочетающая миниатюрные культуры возмущений с мини-объемной транскриптомикой. Оптимизированный протокол mini-bulk обеспечивает информативные биологические сигналы на экономически эффективной глубине секвенирования, что позволяет проводить обширный скрининг известных лекарств и новых молекул. В зависимости от выбранного лечения и инкубационного времени, этот протокол приведет к секвенированию библиотек в течение примерно 2 дней. Благодаря наличию нескольких остановочных точек в рамках этого протокола, подготовка библиотеки, а также секвенирование могут выполняться независимо от времени. Возможна одновременная обработка большого количества образцов; Измерение до 384 образцов было проведено без потери качества данных. Также не существует известных ограничений по количеству состояний и/или препаратов, несмотря на вариабельность оптимальных сроков инкубации лекарств.

Introduction

Разработка новых лекарственных средств представляет собой сложный и трудоемкий процесс, который включает в себя идентификацию потенциальных лекарственных средств и их мишеней, оптимизацию и синтез лекарственных препаратов-кандидатов, а также проверку их эффективности и безопасности в доклинических и^{клинических испытаниях1}. Традиционные методы скрининга лекарственных средств, т.е. систематическая оценка библиотек соединений-кандидатов для терапевтических целей, предполагают использование животных моделей или клеточных анализов для проверки воздействия на конкретные мишени или пути. Несмотря на то, что эти методы были успешны в выявлении лекарств....

Protocol

Этот протокол соответствует рекомендациям местных комитетов по этике Боннского университета.

1. Приготовление буферов, растворов и оборудования

1. Приготовьте растворы и соберите материалы, описанные в Таблице материалов.
2. Водяную баню нагрет?.......

Discussion

Открытие и разработка лекарств могут значительно выиграть от целостного взгляда на клеточные процессы, который может обеспечить массовая транскриптомика. Тем не менее, этот подход часто ограничен высокой стоимостью эксперимента со стандартным протоколом массового секвенирования РН.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL conical tube	fisher scientific	10203001
Adhesive PCR Plate Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A 63881
Betaine	Sigma-Aldrich	61962
Cell culture grade 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	for adherent cells
Ethanol	Sigma-Aldrich	51976
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	26140079
Filter tips (10 µL)	Gilson	F171203
Filter tips (100 µL)	Gilson	F171403
Filter tips (20 µL)	Gilson	F171303
Filter tips (200 µL)	Gilson	F171503
Guanidine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	G3272
ISPCR primer (10 µM)	Biomers.net GmbH	SP10006	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Magnetic stand 96	Ambion	AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	AB0600
PCR plate sealer	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Penicillin / Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15070063
Qubit 4 fluorometer	Invitrogen	15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640 cell culture medium	Gibco	61870036	If not working with PBMCs, adjust to cell type
SMART dT30VN primer	Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Standard lab equipment	various	various	e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycler (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer	Sigma-Aldrich	Z258415