Rilevamento e quantificazione di mono-ramnolipidi e di-ramnolipidi prodotti da Pseudomonas aeruginosa

Summary

Pseudomonas aeruginosa produce i biotensioattivi ramnolipidici. La cromatografia su strato sottile rileva e determina la proporzione di mono- e di-ramnolipidi prodotti da ciascun ceppo. La quantificazione dei ramnolipidi totali comporta la valutazione degli equivalenti di ramnosio presenti in questi biotensioattivi estratti dai surnatanti di coltura utilizzando il metodo dell'orcinolo.

Abstract

Il batterio ambientale Pseudomonas aeruginosa è un patogeno opportunista con un'elevata resistenza agli antibiotici che rappresenta un pericolo per la salute. Questo batterio produce alti livelli di biotensioattivi noti come ramnolipidi (RL), che sono molecole con un significativo valore biotecnologico ma sono anche associate a tratti di virulenza. A questo proposito, l'individuazione e la quantificazione dell'RL possono essere utili sia per applicazioni biotecnologiche che per progetti di ricerca biomedica. In questo articolo, dimostriamo passo dopo passo la tecnica per rilevare la produzione delle due forme di RL prodotte da P. aeruginosa mediante cromatografia su strato sottile (TLC): i mono-ramnolipidi (mRL), molecole costituite da un dimero di acidi grassi (principalmente C10-C10) legato a una frazione ramnosio, e i di-ramnolipidi (dRL), molecole costituite da un dimero simile di acidi grassi legato a due frazioni ramnosio. Inoltre, presentiamo un metodo per misurare la quantità totale di RL basato sull'idrolisi acida di questi biotensioattivi estratti da un surnatante di coltura di P. aeruginosa e il successivo rilevamento della concentrazione di ramnosio che reagisce con l'orcinolo. La combinazione di entrambe le tecniche può essere utilizzata per stimare la concentrazione approssimativa di mRL e dRL prodotti da un ceppo specifico, come esemplificato qui con i ceppi tipo PAO1 (filogruppo 1), PA14 (filogruppo 2) e PA7 (filogruppo 3).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa è un batterio ambientale e un patogeno opportunista di grande preoccupazione a causa della sua produzione di tratti associati alla virulenza e della sua elevata resistenza agli antibiotici ^1,2. Un caratteristico metabolita secondario prodotto da questo batterio è il biotensioattivo RL, che viene prodotto in modo coordinato con diversi tratti associati alla virulenza come la fenazina piocianina, un antibiotico con attività redox, e la proteasi elastasi³. Le proprietà tensio-attive ed emulsionanti dell'RL sono state sfruttate in divers....

Protocol

Questa procedura è schematizzata nella Figura 1 supplementare. I reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Rilevazione di mRL e dRL in surnatanti di coltura di P. aeruginosa mediante TLC

1. Iniziare con il brodo centrifugato del ceppo di interesse P. aeruginosa , coltivato in terreno liquido per 24 ore (per raggiungere la fase st.......

Discussion

Il metodo più accurato per rilevare e quantificare l'RL è l'HPLC accoppiato alla spettrometria di massa (MS)^7,8,27; Tuttavia, richiede attrezzature specializzate e costose che potrebbero non essere accessibili a molti ricercatori. I metodi qui descritti possono essere eseguiti di routine con materiali e attrezzature di laboratorio di base per rilevare e stimare le concentrazioni di RL, ma presentano alcune limitazioni, in part.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C