Тест на активное избегание места (APA) — эффективная, универсальная и воспроизводимая задача пространственного обучения для мышей

Summary

Здесь мы представляем протокол теста на избегание активного места, парадигмы пространственного обучения, зависящей от гиппокампа, разработанной для грызунов. Изменение ключевых параметров позволяет повторно тестировать животных до и после лечения или с течением времени.

Abstract

Гиппокамп-зависимое пространственное обучение у грызунов было проверено с использованием различных методов. К ним относятся водный лабиринт Морриса (MWM), Y-лабиринт и задачи по определению местоположения нового объекта (NOL). В последнее время в качестве альтернативы этим более традиционным подходам была разработана задача активного избегания места (APA). В задаче APA мыши должны использовать пространственные подсказки, размещенные вокруг вращающейся арены, чтобы избежать неподвижной зоны удара. Благодаря множеству параметров, которые можно регулировать, задача APA показала себя очень универсальным подходом. Его можно использовать в продольном и многократном режиме для одной и той же когорты мышей. Здесь мы предоставляем подробный протокол для успешного выполнения задачи APA. Мы также выделяем альтернативные подходы APA, которые можно использовать для изучения различных компонентов пространственного обучения. Описываются процессы сбора и анализа данных. Обсуждаются критические шаги во время задания APA, чтобы повысить вероятность успешного проведения теста. Задание APA имеет несколько преимуществ по сравнению с более традиционными тестами на пространственную навигацию. Его целесообразно использовать с пожилыми мышами или мышами с фенотипами заболеваний, такими как болезнь Альцгеймера. Сложность задачи можно легко изменить, что позволяет протестировать широкий спектр штаммов мышей. Кроме того, задание APA подходит для тестирования животных, перенесших операцию или экспериментальные вмешательства, которые могли повлиять на двигательную или нервную функцию, такие как инсульт или черепно-мозговая травма.

Introduction

Активное избегание места (APA) является эффективным инструментом для проверки пространственного обучения в зависимости от гиппокампа у грызунов 1,2,3,4. Во время задания APA животное помещается на вращающуюся арену и должно использовать визуальные подсказки, чтобы сориентироваться и избежать аверсивной зоны шока⁵. Вращение арены гарантирует, что мышь не сможет использовать идиотский подход для навигации, а также не может использовать запаховые метки, поскольку эти подсказки вращаются на платформе, в то время как зона удара остается неподвижной⁵. Изменение скорости и направления арены, а также расположения зоны удара и визуальных подсказок позволяет повторно тестировать мышей несколько раз ^6,7,8. APA предлагает несколько явных преимуществ по сравнению с водным лабиринтом Морриса (MWM), одним из наиболее широко используемых тестов пространственного обучения. Важно отметить, что мыши испытывают отвращение к плаванию и считают задачу MWM чрезвычайно стрессовой⁹. Кроме того, сообщалось, что старые мыши плавали во время задачи¹⁰ MWM, что во многих случаях делало ее непригодной в качестве задачи пространственного обучения. Кроме того, поскольку задача MWM требует скрытой, погруженной платформы, которую мыши могут найти во время тестирования. Это требует, чтобы вода была непрозрачной, что обычно достигается добавлением белой краски. Отслеживание и анализ животных во время поведенческих задач требует достаточного контраста между объектом и окружением, исключая определенные линии мышей, такие как Swiss или BALB/c, из тестирования в MWM. В задаче APA эта проблема обходится за счет добавления черного пластика под сетку.

Несколько парадигм APA были разработаны для проверки пространственного обучения, демонстрируя его полезность в качестве эффективного поведенческого инструмента. Например, приобретение, удержание и закрепление пространственного обучения обычно достигается путем ежедневного тестирования животных, которое может варьироваться от 3 до 5 дней 6,7,11,12. Память и обучение количественно оцениваются путем сравнения количества шоков, полученных каждый день приобретения. Время до первого входа и максимальное время избегания зоны шока также являются важными параметрами, которые могут быть использованы для определения изменений в способности к обучению во время выполнения задания. В качестве альтернативы пространственную рабочую память можно проверить, проведя одну 30-минутную сессию APA ^2,13, где пространственное обучение измеряется как изменения в течение сеанса путем сравнения производительности, такой как шоковое число, в 5-минутных интервалах.

В этой статье мы опишем задание APA и выделим ключевые особенности, которые необходимо учитывать при проведении этого теста на пространственное обучение.

Protocol

Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по этике животных Университета Квинсленда в соответствии с руководящими принципами Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Австралии (номер утверждения: QBI/189/15).

1. Обустройство комнаты APA

ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат APA включает в себя приподнятую арену с металлическим решетчатым полом, окруженным прозрачной круглой границей высотой 32 см. Металлические стержни равномерно расположены (на расстоянии 0,5 см друг от друга) и имеют диаметр 0,3 см.

1. Убедитесь, что устройство APA находится в раме камеры, установленной на потолке. Отслеживайте мышь с помощью имеющегося в продаже программного обеспечения для отслеживания животных.
2. Арена APA обычно вращается со скоростью 1 об/мин, а внутри вращающейся арены установлена заранее обозначенная зона неподвижного удара на 60°. Когда мышь войдет в зону удара, нанесите слабый удар ногой 0,5 мА (60 Гц, 500 мс).
3. Убедитесь, что местоположение зоны удара остается постоянным во время испытания и установлено электронным способом в экспериментальной установке. Вращающаяся арена переносит мышь в зону удара, если мышь активно не двигается, чтобы избежать этого.
4. Разместите четыре новых визуальных подсказки на четырех разных стенах комнаты на той же высоте, что и вращающаяся платформа, обычно на расстоянии 30-50 см от арены. Убедитесь, что метки нейтральных цветов, например, черно-белые символы или фигуры, напечатанные на бумаге формата А3 и заламинированные для удобства очистки (рис. 1A).
5. Убедитесь, что интенсивность освещения в комнате находится в пределах 30-70 люкс.
6. Перед запуском откройте программу Tracker и выберите задачу APA.
7. В разделе Параметры для Tracker 2D выберите вкладку Эксперимент . Здесь убедитесь, что выбран параметр Place Avoidance- One Frame- Position Only . Это позволит настроить необходимые параметры. Сохраните файл конфигурации и настройте его по мере необходимости.
8. На вкладке Эксперимент задайте продолжительность эксперимента в поле Время эксперимента . Типичная продолжительность эксперимента составляет 600 с или 10 минут.
9. Убедитесь, что выбран параметр Включить таймер . Измените параметры удара в области таймера, как описано выше.
10. Введите общие сведения об эксперименте в поле, отведенное в области Room Frame на вкладке Experiment . Например, убедитесь, что имя выходного файла по умолчанию заполнено датой, простым экспериментальным идентификатором и днем тестирования. Завершите имя символом подчеркивания "_", чтобы во время эксперимента можно было добавить уникальный идентификатор мыши.
11. В области Room Frame также находится вкладка Target . Нажмите кнопку «Редактировать », чтобы убедиться, что вся арена включена в интересующий регион. Затем выберите Arc , чтобы задать настраиваемые параметры для размера и местоположения ударной целевой зоны (рис. 1B).
12. Откройте вкладку Отслеживание , чтобы настроить параметры для обеспечения успешного отслеживания мышей. Блок контраста имеет параметры Dark или Light, чтобы разрешить как темные (например, C57Bl/6), так и светлые (например, BALB/c) мыши. Это создает эффективный контраст между фоном и мышами. При использовании линий мышей-альбиносов поместите кусок черного пластика под арену, чтобы можно было достичь этого контраста (Рисунок 2).
13. Задайте размеры мышей и диапазоны площадей в этой области. Установите эти параметры, чтобы эффективно распознавать мышь, когда она находится на арене. Кроме того, установите их после нажатия кнопки From Calibrator .
14. Нажмите кнопку From Calibrator , чтобы убедиться, что арена полностью находится в маске интересующей области.
    1. Запустите арену в этой вкладке, чтобы убедиться, что при вращении арены арена остается в маске. Эта вкладка также важна для выбора соответствующего порога контрастности. Переместите красную линию на панели Порог , чтобы настроить порог контрастности.
       ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 3A показан оптимальный выбор порога, о чем свидетельствует сплошная оранжевая область и синий «X», где расположена мышь. Низкий порог показан на рисунке 3B и показывает только крапчатый оранжевый цвет и отсутствие буквы «X».
15. Используйте вкладку «Устройства » и задайте направление вращения и скорость арены с помощью кнопки скорости. Выберите положительную и отрицательную скорости, представляющие вращение по часовой стрелке и против часовой стрелки. Задайте интенсивность удара в разделе Источник тока . Наиболее распространенной настройкой для мышей является вращение 1 об/мин и удар током 0,5 мА.
16. Измените способ и время подачи ударов на вкладке «Источник тока ».
    1. Убедитесь, что для текущего режима выбрано значение Отслеживать зависимые. Это обеспечит поражение электрическим током, когда мышь перемещается в зону поражения током.
    2. Выберите Время для подачи ударов через интервал времени, заданный пользователем. Используйте ранее записанные дорожки, чтобы шокировать мышь, выбрав «Из файла». Это необходимо для того, чтобы управлять мышью в ярме, подвергаясь одинаковому количеству ударов одинаковой продолжительностью и интенсивностью, независимо от пространственного обучения.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладки «Вывод файлов » и «Окно» позволяют сохранять данные и видеофайлы в определенном каталоге. Кнопка «Из изображения » на вкладке «Вывод файла» также позволяет выбрать интересующую область для захвата всей арены.
17. Отступите за занавес и начните суд. Присутствие экспериментатора рядом с ареной и любой ненужный шум могут повлиять на производительность животных.
18. Убедитесь, что любой шум и запах ограничены во время испытания, что может дать мыши еще один сигнал, влияющий на ее производительность. Примеры, позволяющие свести это к минимуму, включают закрытие контейнера для клинических отходов, использование помещений, удаленных от шумных лабораторных помещений, и тщательную очистку оборудования между мышами. Исследователи могут рассмотреть возможность использования генератора белого шума для маскировки несвязанных внешних шумов.
19. Пусть подстилка в домашней клетке остается неизменной в течение всего периода поведенческого тестирования, так как это может обеспечить новую стимуляцию и повлиять на поведение.
20. Чтобы избежать суточных колебаний, проводите тестирование в одно и то же время каждый день.

2. Привыкание к работе с экспериментатором

1. Обрабатывайте каждую мышь ежедневно в течение от 30 с до 1 минуты в течение как минимум 2-3 дней до тестирования. Обращение с животными значительно снижает стресс и тревожное поведение во время испытаний.
2. Используйте один и тот же лабораторный халат и избегайте использования сильных дезодорантов, одеколонов или духов во время привыкания и тестирования.

3. Привыкание к арене АПА (1 день)

1. Принесите мышь в прихожую или комнату для тестирования на привыкание. Оставьте мышь привыкать минимум на 30 минут. Установите интенсивность света в прихожей или комнате для тестирования до того, как мыши привыкнут.
2. Настройте программное обеспечение Tracker.
   1. Создайте папку для конкретного эксперимента. В зависимости от экспериментальной парадигмы, имейте отдельные папки для каждого дня или испытания. Настройте конфигурации эксперимента, как описано выше, и сохраните эти конфигурации для использования в будущем.
   2. Перед запуском пробной версии откройте сохраненную конфигурацию, щелкнув вкладку Файл , затем нажмите на символ Сохранить , добавьте уникальный идентификатор мыши в открывшемся окне и запустите пробную версию, нажав вкладку Воспроизвести .
3. Приучите мышь к аппарату APA, выставив ее на вращающуюся арену в течение 5 минут без ударов током.
4. Выньте мышь из домашней клетки, подняв ее с основания хвоста и аккуратно положив на руку в перчатке. Транспортируйте мышь к аппарату APA и поместите ее подальше от зоны удара, лицом к стене.
5. Отступите за занавес и начните суд.
6. По окончании тестирования извлеките мышь и вернитесь в домашнюю клетку.
7. Соберите всю мочу и экскременты и тщательно очистите решетку 80% этанолом.
8. Повторите шаги 3.4-3.7 для всех мышей.

4. Обучение приобретению с использованием APA (1-6 дней)

1. Установите освещение в помещении на те же условия, что и в день привыкания.
2. Принесите мышь в прихожую или комнату для тестирования и дайте ей привыкнуть не менее 30 минут.
3. Настройте программное обеспечение Tracker, как описано выше.
4. Установите продолжительность пробного периода.
5. Убедитесь, что источник тока включен и установлен (т. е. 0,5 мА).
6. Поместите мышь на арену вдали от зоны удара и лицом к стене.
7. Отступите за занавес и начните испытание, нажав кнопку «Играть ». Следите за мышью на экране компьютера и при необходимости вмешивайтесь. Например, мышь не получает ударов током или выглядит чрезмерно напряженной, о чем свидетельствуют чрезмерные прыжки или вокализация.
8. По окончании тестирования извлеките мышь и вернитесь в домашнюю клетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мыши получают удары током и реагируют на них. Мыши реагируют на шок, вставая на дыбы и издавая звуки. Если это не так, возможно, они не получают удар током. Это может быть связано с неровностями в сети или из-за неадекватного отслеживания. Поэтому очистка сетки после каждой попытки и оптимизация отслеживания мыши, как обсуждалось выше, имеют важное значение.

5. Обучение реверсивному приобретению (по желанию, 1-6 дней)

1. В задаче разворота переместите зону удара в новое место, обычно на 180° от предыдущего положения. Оцените способность мыши гибко осваивать новое местоположение зоны удара. Сигналы комнаты обычно не меняются во время обратного обучения.
2. Повторите шаги 3.4-3.7 для всех мышей.

6. Пробная проба (по желанию, 1 день)

1. В исследовании зонда измерьте время до первого входа и/или максимальное время избегания зоны поражения током.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это указывает на консолидацию памяти после этапа сбора. Хорошо обученная мышь будет избегать входа в зону удара в течение длительного периода времени (>60 секунд), демонстрируя признаки пространственного обучения.
2. Установите интенсивность освещения в комнате, как в день обучения приобретению.
3. Приучайте мышь к тестированию или прихожей в течение 30 мин.
4. Настройте программное обеспечение Tracker.
5. Установите продолжительность испытания на то же время, что и ранее проведенный период тестирования (например, 10 минут или 30 минут, в зависимости от параметров испытания).
6. Не применяйте электрошок для этого испытания.
7. Поместите мышь на противоположную сторону зоны аверсивного удара, лицом к стене.
8. Начните испытание и отступите за занавес.
9. Убедитесь, что мышь отслеживается эффективно.
10. Следите за мышью на экране компьютера и останавливайте испытание, когда она входит в зону поражения током. Некоторые исследователи предпочитают продолжать испытание в течение 5 минут, чтобы увидеть, продолжает ли мышь возвращаться в зону шока.
11. Аккуратно возьмите мышь в руки и вернитесь в домашнюю клетку.
12. Убедитесь, что вся моча и испражнения собраны, а решетка тщательно очищена 80% (v/v) этанолом.

7. Анализ трека

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение задачи может быть достигнуто с помощью различных программ для отслеживания. Ниже показано, как входящее в комплект программное обеспечение используется для определения производительности во время задачи APA. В этом случае данные анализируются с помощью программы Track Analysis .

1. Чтобы проанализировать данные, откройте программу «Анализ отслеживания » и выберите «Уклонение » из выпадающего меню в главном окне.
2. Нажмите « Добавить задачу », чтобы загрузить файлы данных, сохраненные на этапе сбора, в новом окне. В поле Имя группы создайте группу для анализа, например, День 1 или Время анализа.
3. Щелкните Выходной каталог, чтобы выбрать местоположение для сохранения проанализированных данных.
4. Добавьте файлы для анализа, щелкнув вкладку Add Files и выбрав файлы с локального диска.
5. Установите время для анализа, щелкнув вкладку Установить время . Это дает возможность определить период, который будет анализироваться, т.е. от 0 до 600 с. Как вариант, анализируйте данные в ячейках, т. е. за 60 с.
6. После добавления всех треков перейдите на вкладку Анализ и выберите Запустить анализ для анализа данных. В результате анализа будет создано несколько папок. Данные для анализа будут находиться в папке TBLfiles . Откройте эти файлы данных в электронной таблице и используйте их для дальнейшего анализа, т.е. попарного сравнения или повторных измерений ANOVA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ также создаст другие папки, в том числе файлы PS, которые будут содержать одностраничное описание мышей во время тестирования, показывающее карту трасс и места получения ударов.

Discussion

В заключение, тест на избегание активного места является эффективной задачей пространственного обучения, которую можно использовать на различных линиях мышей и экспериментальных условиях. Задача APA преодолевает ограничения, связанные с другими парадигмами пространственного обучения¹⁴, такими как MWM, которая является стрессовой для мышей, измеряемой уровнем кортизола⁹. MWM также не подходит для старых мышей, которые, как сообщается, плавают во время выполнения задачи¹⁰. Хотя другие тесты на пространственное обучение, такие как лабиринт Барнса и тест на определение местоположения нового объекта, менее стрессовые, они ограничены тем, как часто можно проводить повторное тестирование на одной и той же когорте мышей. Таким образом, основное преимущество задачи APA заключается в том, что ее можно использовать несколько раз, так как несколько параметров можно настроить для поддержания новизны. Действительно, мы использовали задачу APA до 5 раз на одной и той же когорте мышей, чтобы изучить эффект абляции гиппокампа и последующий эффект упражнения⁸. В каждом случае параметры, включая вращение арены, зону удара и пространственные подсказки, были изменены между тестами. Это было эффективно для обеспечения того, чтобы мыши использовали пространственные навигационные подсказки для повторного обучения задаче, о чем свидетельствуют контрольные животные, начиная с большого количества ударов, а затем уменьшая их в течение последующих тестовых дней для^{каждого периода тестирования}. Как правило, в конце 5-дневного теста парадигмы мы считаем, что любое животное, которое получило более 10 ударов током в последний день или имеет максимальное избегание менее 60 с, не выучило парадигму.

Помимо возможности легко изменять настройки, чтобы разрешить несколько раундов пространственного тестирования, задача APA гарантирует, что мыши должны использовать пространственную навигацию, чтобы эффективно избегать зоны удара. Например, животные должны использовать внешние сигналы, чтобы найти и избежать входа в неподвижную зону удара, уйдя от нее⁵. Поскольку арена вращается, животные не могут использовать идиотический подход для навигации, а также не могут использовать экстероцептивные сигналы, такие как запах, потому что эти сигналы вращаются вместе с ареной, в то время как зона удара и пространственные сигналы остаются неподвижными^.

Также важно убедиться, что мыши надлежащим образом приучены к исследователю и АПА. Интенсивность удара ногой также должна быть оптимизирована, так как как как слишком низкая, так и слишком высокая интенсивность удара может поставить под угрозу способность мышей обучаться и выполнять задачу⁵. Интенсивность ударной волны обычно устанавливается на 0,5 мА и не должна превышать 0,7 мА. Для животных с повышенным тревожным поведением рассмотрите возможность снижения интенсивности как света, так и интенсивности удара ногой. Повышенное беспокойство во время задания APA может проявляться либо в виде чрезмерных прыжков, неконтролируемого бега по арене, либо в виде длительного замерзания. В описанном здесь протоколе использовалась интенсивность удара 0,5 мА, та же интенсивность, которая ранее использовалась для BALB/c, который, как известно, имеет более высокое тревожное^{поведение.}

Здесь мы опишем программное обеспечение для отслеживания животных, поставляемое компанией, которая предоставила используемую установку для активного избегания места. Альтернативное программное обеспечение для отслеживания видео также подходит для анализа поведенческих показателей. Эти программы также могут точно измерять и анализировать производительность мыши во время задач APA. Эти программы позволяют создать несколько зон и локаций на арене АПА для оценки поведения. Арена для APA состоит из одной треугольной зоны удара, где измеряется количество входов, время первого входа и время, проведенное в зоне удара. Дополнительные зоны также могут быть добавлены внутри арены. Например, мы можем добавить центральную зону или зону, противоположную зоне удара, чтобы измерить затраченное время и расстояние, пройденное в этих зонах, в качестве стратегии животного, чтобы избежать зоны отвращения. Эти программы отслеживают центр масс мыши, который затем сохраняется и отображается над системой отсчета для визуального контроля (рис. 6A, B). Наконец, также можно создать тепловую карту плотности для индивидуальной и групповой производительности (рисунок 6C).

При выполнении задачи APA существуют потенциальные проблемы, которые необходимо решить. Иногда мышей нужно будет исключить из анализа из-за отсутствия реакции на зону удара. Как всегда, исключение следует рассматривать только в том случае, если они удовлетворяют заранее определенным условиям выбросов, например, выходят за пределы 2 стандартных отклонений от среднего значения. Сложные поведенческие задачи, такие как APA, обычно требуют высоких значений N у животных. Мы предлагаем провести анализ мощности, чтобы рассчитать подходящий размер выборки перед проведением APA. Это будет зависеть от используемого штамма и групп лечения. Из опыта мы обнаружили, что значение n 10 или более для каждой группы обеспечивает достаточную мощность при проведении экспериментов APA. Основная проблема с этой задачей — обеспечение качественного отслеживания мыши во время выполнения задачи. Стадия привыкания к заданию должна быть использована для подтверждения того, что это происходит. Мыши, не реагирующие на удар, часто возникают из-за того, что они застревают между стержнями сетки. Поэтому важно чистить установку после каждого животного и удалять любые экскременты или мочу. Это также снизит стресс для последующих животных. Задание АПА обычно включает в себя 5-дневную парадигму, которая может представлять некоторые ограничения для исследований, включающих вмешательства, эффективные менее 5 дней; Тем не менее, кратковременная память или пространственное обучение все еще могут быть оценены для таких исследований с использованием 30-минутного подхода с одним сеансом.

В целом, в этой статье представлено подробное описание того, как настроить и использовать парадигму активного избегания места для проверки пространственного обучения мышей. Возможность изменять условия таким образом, чтобы можно было протестировать несколько линий мышей разного цвета, является явным преимуществом по сравнению с другими, более традиционными пространственными тестами, такими как MWM. Кроме того, модификация нескольких параметров позволяет проводить повторное тестирование, чтобы можно было точно сравнить изменения в пространственном обучении во время различных экспериментальных парадигм или во время физиологического старения. За короткий период времени тест APA показал себя точной и эффективной альтернативой пространственному обучению, зависящему от гиппокампа. В будущем задача APA может быть использована в качестве надежного метода для оценки терапевтических или физических вмешательств на когнитивное и пространственное поведение как у мышей дикого типа, так и у трансгенных мышей.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Constant Current Source CS02	BioSignal Group	N/A	Acton, Massachusetts, United States
Control Box	BioSignal Group	N/A	Acton, Massachusetts, United States
Ethovision	Noldus	version 16	Wageningen, Netherlands
Shock Scrambler	BioSignal Group	N/A	Acton, Massachusetts, United States
Track Analysis	BioSignal Group	version 2.2	Acton, Massachusetts, United States
Tracker Programme	BioSignal Group	version: 2.36	Acton, Massachusetts, United States