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Identificazione e analisi di progenitori miogenici in vivo durante la lesione acuta del muscolo scheletrico mediante citometria di massa unicellulare ad alta dimensionalità
In This Article
Summary
Il protocollo qui presentato consente l'identificazione e l'analisi ad alta dimensionalità delle cellule staminali muscolari e delle cellule progenitrici mediante citometria di massa a singola cellula e la loro purificazione mediante FACS per studi approfonditi della loro funzione. Questo approccio può essere applicato per studiare le dinamiche di rigenerazione in modelli di malattia e testare l'efficacia degli interventi farmacologici.
Abstract
La rigenerazione muscolare scheletrica è un processo dinamico guidato dalle cellule staminali muscolari adulte e dalla loro progenie. Per lo più quiescenti in uno stato stazionario, le cellule staminali muscolari adulte si attivano in seguito a una lesione muscolare. Dopo l'attivazione, proliferano e la maggior parte della loro progenie si differenzia per generare cellule muscolari competenti per la fusione, mentre le rimanenti si autorinnovano per ricostituire il pool di cellule staminali. Mentre l'identità delle cellule staminali muscolari è stata definita più di un decennio fa, sulla base della co-espressione di marcatori di superficie cellulare, i progenitori miogenici sono stati identificati solo di recente utilizzando approcci unicellulari ad alta dimensione. Qui, presentiamo un metodo di citometria di massa a singola cellula (citometria a tempo di volo [CyTOF]) per analizzare le cellule staminali e le cellule progenitrici in lesioni muscolari acute per risolvere le dinamiche cellulari e molecolari che si svolgono durante la rigenerazione muscolare. Questo approccio si basa sulla rilevazione simultanea di nuovi marcatori di superficie cellulare e fattori chiave di trascrizione miogenica la cui espressione dinamica consente l'identificazione di cellule staminali attivate e popolazioni di cellule progenitrici che rappresentano punti di riferimento della miogenesi. È importante sottolineare che viene descritta una strategia di smistamento basata sul rilevamento dei marcatori di superficie cellulare CD9 e CD104, che consente l'isolamento prospettico delle cellule staminali muscolari e delle cellule progenitrici utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per studi approfonditi della loro funzione. Le cellule progenitrici muscolari forniscono un anello mancante critico per studiare il controllo del destino delle cellule staminali muscolari, identificare nuovi bersagli terapeutici per le malattie muscolari e sviluppare applicazioni di terapia cellulare per la medicina rigenerativa. L'approccio qui presentato può essere applicato allo studio delle cellule staminali muscolari e delle cellule progenitrici in vivo in risposta a perturbazioni, come gli interventi farmacologici mirati a specifiche vie di segnalazione. Può anche essere utilizzato per studiare le dinamiche delle cellule staminali muscolari e delle cellule progenitrici in modelli animali di malattie muscolari, facendo progredire la nostra comprensione delle malattie delle cellule staminali e accelerando lo sviluppo di terapie.
Introduction
Il muscolo scheletrico costituisce il tessuto più grande per massa del corpo e regola molteplici funzioni, dalla vista alla respirazione, dalla postura al movimento, nonché al metabolismo1. Pertanto, mantenere l'integrità e la funzione del muscolo scheletrico è fondamentale per la salute. Il tessuto muscolare scheletrico, costituito da fasci stretti di miofibre multinucleate circondate da una complessa rete di nervi e vasi sanguigni, mostra un notevole potenziale rigenerativo 1,2.
I principali motori della rigenerazione del m....
Protocol
Le procedure sugli animali sono state approvate dall'ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali (protocollo # 2022-15-0201-01293) e gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali dell'Università di Aarhus. L'analgesia (buprenorfina) viene fornita in acqua potabile 24 ore prima dell'infortunio affinché i topi si adattino al gusto. La fornitura di buprenorfina nell'acqua potabile viene continuata per 24 ore dopo l'infortunio. Insieme a un'in.......
Representative Results
Qui presentiamo una panoramica della configurazione sperimentale per l'utilizzo di questo approccio combinato che include (i) l'analisi CyTOF ad alta dimensionalità di un decorso temporale di lesione acuta mediante iniezione di notexin per studiare la dinamica cellulare e molecolare delle cellule staminali e progenitrici nel muscolo scheletrico (Figura 1, schema in alto); e (ii) FACS di cellule staminali e progenitrici utilizzando due marcatori di superfici.......
Discussion
La rigenerazione muscolare scheletrica è un processo dinamico che si basa sulla funzione delle cellule staminali adulte. Mentre studi precedenti si sono concentrati sul ruolo delle cellule staminali muscolari durante la rigenerazione, la loro progenie in vivo è stata poco studiata, principalmente a causa della mancanza di strumenti per identificare e isolare queste popolazioni cellulari 15,16,17,18.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri della FACS Core Facility del Dipartimento di Biomedicina dell'Università di Aarhus per il supporto tecnico. Ringraziamo Alexander Schmitz, direttore dell'Unità di Citometria di Massa presso il Dipartimento di Biomedicina, per il confronto e il supporto. Le illustrazioni scientifiche sono state create utilizzando Biorender.com. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione Starting Grant dell'Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) e da una sovvenzione Start Package (0071113) della Novo Nordisk Foundation a E.P.
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 20 G needle | KDM | KD-fine 900123 | |
| 28 G, 0.5 mL insulin syringe | BD | 329461 | |
| 29 G, 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| 3 mL syringes | Terumo medical | MDSS03SE | |
| 40 µm cell strainers | Fisher Scientific | 11587522 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352002 | |
| 5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainer | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringes | Terumo medical | SS05LE1 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0.5 mg/mL |
| anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-α7 integrin PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III (4 laser) instrument | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561, and 633 nm laser |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104 (Clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; In-house conjugated |
| CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A) | Biolegend | 105701 | Er170; In-house conjugated |
| CD11b (Clone: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; In-house conjugated |
| CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; In-house conjugated |
| CD31 (Clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; In-house conjugated |
| CD34 (Clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; In-house conjugated |
| CD44 (Clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; In-house conjugated |
| CD45 (Clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; In-house conjugated |
| CD9 (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; In-house conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; In-house conjugated |
| CD98 (Clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; In-house conjugated |
| Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer | Standard Biotools | 201240 | |
| Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | cationic nucleic acid intercalator |
| Cisplatin | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride) | Merck | P4394 | |
| Clear 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Collagenase, Type II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Counting chamber | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; In-house conjugated |
| DAPI (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
| Dark 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM (low glucose, with pyruvate) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads) | Standard Biotools | 201078 | Calibration beads |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil origin | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Forceps Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Forceps Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| Helios CyTOF system | Standard Biotools | N/A | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurane/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (Clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; In-house conjugated |
| MyoD (Clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; In-house conjugated |
| MyoG (Clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; In-house conjugated |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES Filters | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C |
| Nutrient mixture F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
| pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; In-house conjugated |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PES Filter Units 0.20 μM | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES Syringe Filter | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% EM grade | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb (Clone: J112-906) | Standard Biotools | 3166011A | Er166 |
| pS6 kinase (Clone: N7-548) | Standard Biotools | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (Clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; In-house conjugated |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Sterile saline solution 0.9% | Fresenius | B306414/02 | |
| α7 integrin (Clone: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; In-house conjugated |
References
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.
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