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Identificação e análise de progenitores miogênicos in vivo durante lesão muscular esquelética aguda por citometria de massa de célula única de alta dimensão
In This Article
Summary
O protocolo aqui apresentado permite a identificação e análise de alta dimensão de células-tronco musculares e progenitoras por citometria de massa de célula única e sua purificação por FACS para estudos aprofundados de sua função. Essa abordagem pode ser aplicada para estudar a dinâmica de regeneração em modelos de doenças e testar a eficácia de intervenções farmacológicas.
Abstract
A regeneração do músculo esquelético é um processo dinâmico impulsionado por células-tronco musculares adultas e sua progênie. Principalmente quiescentes em um estado estacionário, as células-tronco musculares adultas são ativadas após a lesão muscular. Após a ativação, eles proliferam e a maior parte de sua progênie se diferencia para gerar células musculares competentes para fusão, enquanto o restante se auto-renova para reabastecer o pool de células-tronco. Embora a identidade das células-tronco musculares tenha sido definida há mais de uma década, com base na co-expressão de marcadores de superfície celular, os progenitores miogênicos foram identificados apenas recentemente usando abordagens unicelulares de alta dimensão. Aqui, apresentamos um método de citometria de massa de célula única (citometria por tempo de voo [CyTOF]) para analisar células-tronco e células progenitoras na lesão muscular aguda para resolver a dinâmica celular e molecular que se desdobra durante a regeneração muscular. Essa abordagem é baseada na detecção simultânea de novos marcadores de superfície celular e fatores-chave de transcrição miogênica cuja expressão dinâmica permite a identificação de células-tronco ativadas e populações de células progenitoras que representam marcos da miogênese. É importante ressaltar que uma estratégia de classificação baseada na detecção dos marcadores de superfície celular CD9 e CD104 é descrita, permitindo o isolamento prospectivo de células-tronco musculares e células progenitoras usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para estudos aprofundados de sua função. As células progenitoras musculares fornecem um elo perdido crítico para estudar o controle do destino das células-tronco musculares, identificar novos alvos terapêuticos para doenças musculares e desenvolver aplicações de terapia celular para medicina regenerativa. A abordagem apresentada aqui pode ser aplicada para estudar células-tronco musculares e progenitoras in vivo em resposta a perturbações, como intervenções farmacológicas direcionadas a vias de sinalização específicas. Também pode ser usado para investigar a dinâmica das células-tronco musculares e progenitoras em modelos animais de doenças musculares, avançando nossa compreensão das doenças com células-tronco e acelerando o desenvolvimento de terapias.
Introduction
O músculo esquelético constitui o maior tecido em massa do corpo e regula múltiplas funções, da visão à respiração, da postura ao movimento, bem como o metabolismo1. Portanto, manter a integridade e a função do músculo esquelético é fundamental para a saúde. O tecido muscular esquelético, que consiste em feixes compactados de miofibras multinucleadas cercadas por uma complexa rede de nervos e vasos sanguíneos, exibe notável potencial regenerativo 1,2.
Os principais impulsionadores da regeneração do músculo esquelético são as ....
Protocol
Os procedimentos em animais foram aprovados pela inspeção dinamarquesa de experimentos com animais (protocolo # 2022-15-0201-01293) e os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade de Aarhus. A analgesia (buprenorfina) é fornecida na água potável 24 horas antes da lesão para que os camundongos se adaptem ao sabor. O fornecimento de buprenorfina na água potável é continuado por 24 horas após a lesão. Juntamente com uma injeçã.......
Representative Results
Aqui, apresentamos uma visão geral da configuração experimental para usar essa abordagem combinada, que inclui (i) análise CyTOF de alta dimensão de um curso de tempo de lesão aguda por injeção de notexina para estudar a dinâmica celular e molecular de células-tronco e progenitoras no músculo esquelético (Figura 1, esquema superior); e (ii) FACS de células-tronco e progenitoras usando dois marcadores de superfície celular, CD9 e CD104, para iso.......
Discussion
A regeneração do músculo esquelético é um processo dinâmico que depende da função das células-tronco adultas. Embora estudos anteriores tenham se concentrado no papel das células-tronco musculares durante a regeneração, sua progênie in vivo foi pouco estudada, principalmente devido à falta de ferramentas para identificar e isolar essas populações de células 15,16,17,18........
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do FACS Core Facility no Departamento de Biomedicina da Universidade de Aarhus pelo apoio técnico. Agradecemos a Alexander Schmitz, gerente da Unidade de Citometria de Massa do Departamento de Biomedicina, pela discussão e apoio. Ilustrações científicas foram criadas usando Biorender.com. Este trabalho foi financiado por uma bolsa inicial da Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) e uma bolsa do pacote inicial (0071113) da Fundação Novo Nordisk para a EP
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 20 G needle | KDM | KD-fine 900123 | |
| 28 G, 0.5 mL insulin syringe | BD | 329461 | |
| 29 G, 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| 3 mL syringes | Terumo medical | MDSS03SE | |
| 40 µm cell strainers | Fisher Scientific | 11587522 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352002 | |
| 5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainer | Falcon | 352235 | |
| 5 mL syringes | Terumo medical | SS05LE1 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anti-CD104 FITC (clone: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0.5 mg/mL |
| anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-CD9 APC (clone: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7) | Biolegend | 108126 | Stock = 0.2 mg/mL |
| anti-α7 integrin PE (clone: R2F2)) | UBC AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg/mL |
| BD FACS Aria III (4 laser) instrument | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561, and 633 nm laser |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104 (Clone: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; In-house conjugated |
| CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A) | Biolegend | 105701 | Er170; In-house conjugated |
| CD11b (Clone: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; In-house conjugated |
| CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; In-house conjugated |
| CD31 (Clone: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; In-house conjugated |
| CD34 (Clone: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; In-house conjugated |
| CD44 (Clone: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; In-house conjugated |
| CD45 (Clone: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; In-house conjugated |
| CD9 (Clone: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; In-house conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; In-house conjugated |
| CD98 (Clone: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; In-house conjugated |
| Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-buffer | Standard Biotools | 201240 | |
| Cell-ID Intercalator-Iridium | Standard Biotools | 201192B | cationic nucleic acid intercalator |
| Cisplatin | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride) | Merck | P4394 | |
| Clear 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Collagenase, Type II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Counting chamber | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; In-house conjugated |
| DAPI (1 mg/mL) | BD Biosciences | 564907 | |
| Dark 1.5 mL tube | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Dissection Scissors | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM (low glucose, with pyruvate) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads) | Standard Biotools | 201078 | Calibration beads |
| Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil origin | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Forceps Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Forceps Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| Helios CyTOF system | Standard Biotools | N/A | |
| Horse Serum, heat inactivated, New Zealand origin | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurane/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (Clone: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; In-house conjugated |
| MyoD (Clone: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; In-house conjugated |
| MyoG (Clone: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; In-house conjugated |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES Filters | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C |
| Nutrient mixture F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
| pAkt (Clone: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Clone: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; In-house conjugated |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| PES Filter Units 0.20 μM | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES Syringe Filter | Fisher Scientific | 15206869 | |
| Petri dish | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% EM grade | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb (Clone: J112-906) | Standard Biotools | 3166011A | Er166 |
| pS6 kinase (Clone: N7-548) | Standard Biotools | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (Clone: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; In-house conjugated |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Sterile saline solution 0.9% | Fresenius | B306414/02 | |
| α7 integrin (Clone: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; In-house conjugated |
References
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.
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