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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

O protocolo aqui apresentado permite a identificação e análise de alta dimensão de células-tronco musculares e progenitoras por citometria de massa de célula única e sua purificação por FACS para estudos aprofundados de sua função. Essa abordagem pode ser aplicada para estudar a dinâmica de regeneração em modelos de doenças e testar a eficácia de intervenções farmacológicas.

Abstract

A regeneração do músculo esquelético é um processo dinâmico impulsionado por células-tronco musculares adultas e sua progênie. Principalmente quiescentes em um estado estacionário, as células-tronco musculares adultas são ativadas após a lesão muscular. Após a ativação, eles proliferam e a maior parte de sua progênie se diferencia para gerar células musculares competentes para fusão, enquanto o restante se auto-renova para reabastecer o pool de células-tronco. Embora a identidade das células-tronco musculares tenha sido definida há mais de uma década, com base na co-expressão de marcadores de superfície celular, os progenitores miogênicos foram identificados apenas recentemente usando abordagens unicelulares de alta dimensão. Aqui, apresentamos um método de citometria de massa de célula única (citometria por tempo de voo [CyTOF]) para analisar células-tronco e células progenitoras na lesão muscular aguda para resolver a dinâmica celular e molecular que se desdobra durante a regeneração muscular. Essa abordagem é baseada na detecção simultânea de novos marcadores de superfície celular e fatores-chave de transcrição miogênica cuja expressão dinâmica permite a identificação de células-tronco ativadas e populações de células progenitoras que representam marcos da miogênese. É importante ressaltar que uma estratégia de classificação baseada na detecção dos marcadores de superfície celular CD9 e CD104 é descrita, permitindo o isolamento prospectivo de células-tronco musculares e células progenitoras usando classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para estudos aprofundados de sua função. As células progenitoras musculares fornecem um elo perdido crítico para estudar o controle do destino das células-tronco musculares, identificar novos alvos terapêuticos para doenças musculares e desenvolver aplicações de terapia celular para medicina regenerativa. A abordagem apresentada aqui pode ser aplicada para estudar células-tronco musculares e progenitoras in vivo em resposta a perturbações, como intervenções farmacológicas direcionadas a vias de sinalização específicas. Também pode ser usado para investigar a dinâmica das células-tronco musculares e progenitoras em modelos animais de doenças musculares, avançando nossa compreensão das doenças com células-tronco e acelerando o desenvolvimento de terapias.

Introduction

O músculo esquelético constitui o maior tecido em massa do corpo e regula múltiplas funções, da visão à respiração, da postura ao movimento, bem como o metabolismo1. Portanto, manter a integridade e a função do músculo esquelético é fundamental para a saúde. O tecido muscular esquelético, que consiste em feixes compactados de miofibras multinucleadas cercadas por uma complexa rede de nervos e vasos sanguíneos, exibe notável potencial regenerativo 1,2.

Os principais impulsionadores da regeneração do músculo esquelético são as ....

Protocol

Os procedimentos em animais foram aprovados pela inspeção dinamarquesa de experimentos com animais (protocolo # 2022-15-0201-01293) e os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais da Universidade de Aarhus. A analgesia (buprenorfina) é fornecida na água potável 24 horas antes da lesão para que os camundongos se adaptem ao sabor. O fornecimento de buprenorfina na água potável é continuado por 24 horas após a lesão. Juntamente com uma injeçã.......

Representative Results

Aqui, apresentamos uma visão geral da configuração experimental para usar essa abordagem combinada, que inclui (i) análise CyTOF de alta dimensão de um curso de tempo de lesão aguda por injeção de notexina para estudar a dinâmica celular e molecular de células-tronco e progenitoras no músculo esquelético (Figura 1, esquema superior); e (ii) FACS de células-tronco e progenitoras usando dois marcadores de superfície celular, CD9 e CD104, para iso.......

Discussion

A regeneração do músculo esquelético é um processo dinâmico que depende da função das células-tronco adultas. Embora estudos anteriores tenham se concentrado no papel das células-tronco musculares durante a regeneração, sua progênie in vivo foi pouco estudada, principalmente devido à falta de ferramentas para identificar e isolar essas populações de células 15,16,17,18........

Acknowledgements

Agradecemos aos membros do FACS Core Facility no Departamento de Biomedicina da Universidade de Aarhus pelo apoio técnico. Agradecemos a Alexander Schmitz, gerente da Unidade de Citometria de Massa do Departamento de Biomedicina, pela discussão e apoio. Ilustrações científicas foram criadas usando Biorender.com. Este trabalho foi financiado por uma bolsa inicial da Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) e uma bolsa do pacote inicial (0071113) da Fundação Novo Nordisk para a EP

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL centrifuge tubeFisher Scientific07-200-886
20 G needleKDMKD-fine 900123
28 G, 0.5 mL insulin syringe BD329461
29 G, 0.3 mL insulin syringeBD324702
3 mL syringesTerumo medicalMDSS03SE
40 µm cell strainersFisher Scientific11587522
5 mL polypropylene tubes Fisher Scientific352002
5 mL polystyrene test tubes with 35 µm cell strainerFalcon352235
5 mL syringesTerumo medicalSS05LE1
50 mL centrifuge tubeFisher Scientific05-539-13
5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU)MerckI7125-5g
anti-CD104 FITC (clone: 346-11A)Biolegend123605Stock = 0.5 mg/mL
anti-CD11b APC-Cy7 (Clone: M1/70)Biolegend101226Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD31 APC-Cy7 (clone: 390)Biolegend102440Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD45 APC-Cy7 (Clone: 30-F11)Biolegend103116Stock = 0.2 mg/mL
anti-CD9 APC (clone: KMC8)ThermoFisher Scientific17-0091-82Stock = 0.2 mg/mL
anti-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (clone: D7)Biolegend108126Stock = 0.2 mg/mL
anti-α7 integrin PE (clone: R2F2))UBC AbLab67-0010-05Stock = 1 mg/mL
BD FACS Aria III (4 laser) instrumentBD BiosciencesN/A405, 488, 561, and 633 nm laser
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA7030-50G
Buprenorphine 0.3 mg/mLCevaVnr 054594
CD104 (Clone: 346-11A)BD Biosciences553745Dy162; In-house conjugated
CD106/VCAM-1 (Clone: 429 MVCAM.A)Biolegend105701Er170; In-house conjugated
CD11b (Clone: M1/70)BD Biosciences553308Nd148; In-house conjugated
CD29/Integrin β1 (Clone: 9EG7)BD Biosciences553715Tm169; In-house conjugated
CD31 (Clone: MEC 13.3)BD Biosciences557355Sm154; In-house conjugated
CD34 (Clone: RAM34)BD Biosciences551387Lu175; In-house conjugated
CD44 (Clone: IM7)BD Biosciences550538Yb171; In-house conjugated
CD45 (Clone: MEC 30-F11)BD Biosciences550539Sm147; In-house conjugated
CD9 (Clone: KMC8)Thermo Fisher Scientific14-0091-85Yb174; In-house conjugated
CD90.2/Thy1.2 (Clone: 30-H12)BD Biosciences553009Nd144; In-house conjugated
CD98 (Clone: H202-141)BD Biosciences557479Pr141; In-house conjugated
Cell Acquisition Solution/Maxpar CAS-bufferStandard Biotools201240
Cell-ID Intercalator-IridiumStandard Biotools201192Bcationic nucleic acid intercalator
CisplatinMerckP4394Pt195
Cisplatin (cis-Diammineplatinum(II) dichloride)MerckP4394
Clear 1.5 mL tubeFisher Scientific11926955
Collagenase, Type IIWorthington Biochemical CorporationLS004177
Counting chamberMerckBR718620-1EA
CXCR4/SDF1 (Clone: 2B11/CXCR4 )BD Biosciences551852Gd158; In-house conjugated
DAPI (1 mg/mL)BD Biosciences564907
Dark 1.5 mL tubeFisher Scientific15386548
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dissection ScissorsFine Science Tools14568-09
DMEM (low glucose, with pyruvate)Thermo Fisher Scientific11885-092
EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)MerckE5134Na2EDTA-2H20
EQ Four Element Calibration Beads (EQ beads)Standard Biotools201078Calibration beads
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil originThermo Fisher Scientific10270106
Forceps Dumont #5SFFine Science Tools11252-00
Forceps Dumont #7Hounisen.com1606.3350
Goat serumThermo Fisher Scientific16210-072
Helios CyTOF systemStandard BiotoolsN/A
Horse Serum, heat inactivated, New Zealand originThermo Fisher Scientific26-050-088
IdUMerckI7125I127
Iridium-IntercalatorStandard Biotools201240Ir191/193
Isoflurane/Attane VetScanVetVnr 055226
MethanolFisher ScientificM/3900/17
Myf5 (Clone: C-20)Santa Cruz BiotechnologySc-302Yb173; In-house conjugated
MyoD (Clone: 5.8A)BD Biosciences554130Dy164; In-house conjugated
MyoG (Clone: F5D)BD Biosciences556358Gd160; In-house conjugated
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top 0.20 μM PES FiltersThermo Fisher Scientific595-4520
NotexinLatoxanL8104Resuspend to 50 µg/ml in sterile PBS. Keep stocks (e.g. 50 µl) at -20 °C
Nutrient mixture F-10 (Ham's)Thermo Fisher Scientific31550031
pAkt (Clone: D9E)Standard Biotools3152005ASm152
Pax7 (Clone: PAX7)Santa Cruz BiotechnologySc-81648Eu153; In-house conjugated
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) (Pen/Strep)Thermo Fisher Scientific15140122
PES Filter Units 0.20 μMFisher Scientific15913307
PES Syringe FilterFisher Scientific15206869
Petri dishSarstedt82.1472.001
PFA 16% EM gradeMP Biomedicals219998320
Potassium chloride (KCl)Fisher Scientific10375810
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous (KH2PO4)Fisher Scientific10573181
pRb (Clone: J112-906)Standard Biotools3166011AEr166
pS6 kinase (Clone: N7-548)Standard Biotools3172008AYb172
Sca-1 (Clone: E13-161.7)BD Biosciences553333Nd142; In-house conjugated
Sodium AzideSigma AldrichS2002
Sodium chloride (NaCl)Fisher Scientific10553515
Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate (Na2HPO4-6H2O)MerckS9390
Sterile saline solution 0.9%FreseniusB306414/02
α7 integrin (Clone: 3C12)MBL internationalK0046-3Ho165; In-house conjugated

References

  1. Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462 (2020).
  2. Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A.

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