מעקב אחר התנהגות חיפוש מקומי בדרוזופילה

Summary

פרוטוקול זה מתאר בדיקה התנהגותית לרישום התנהגות חיפוש המעוררת סוכר באמצעות Drosophila melanogaster. הבדיקה יכולה לשמש לחקר התנהגויות הקשורות להאכלה וליקוט מזון, כמו גם את המנגנונים העצביים הבסיסיים.

Abstract

התנהגות מזון חיונית להישרדותם של אורגניזמים מכיוון שהיא מאפשרת להם לאתר ולרכוש משאבי מזון חיוניים. בדרוזופילה, רעב מעורר התנהגות חיפוש מובחנת בעקבות צריכת כמויות קטנות של תמיסת סוכר. דו"ח זה מציג מערך ניסויי פשוט לחקר התנהגות חיפוש הנובעת מסוכר במטרה לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיסם. כמויות זעירות של תמיסת סוכר מרוכזת מעוררות התנהגות חיפוש מתמשכת בזבובים. המעורבות של שילוב נתיב בהתנהגות זו נקבעה, שכן זבובים מנצלים את מסלולם כדי לחזור למקום הסוכר. הממצאים האחרונים מספקים עדות לאפנון זמני בהתחלת ועוצמת התנהגות החיפוש לאחר צריכת סוכר. השתמשנו במערך הזה גם להפעלה מלאכותית של נוירונים ספציפיים של קולטני טעם בלוע, מה שמעורר את התנהגות החיפוש. ערכת הכלים הנוירוגנטית Drosophila מציעה מגוון רחב של כלים וטכניקות שניתן לשלב עם פרדיגמת התנהגות החיפוש המעוררת סוכר כדי לחקור את המנגנונים העצביים והגנטיים העומדים בבסיס ליקוט מזון. הבנת הבסיס העצבי של התנהגות חיפוש מונעת רעב בזבובים תורמת לתחום הנוירוביולוגיה בכללותו, ומציעה תובנות לגבי מנגנוני הבקרה השולטים בהתנהגויות אכילה לא רק באורגניזמים אחרים אלא גם בבני אדם.

Introduction

התנהגות של חיפוש מזון וחיפוש מזון היא אסטרטגיית הישרדות בסיסית המוצגת על ידי אורגניזמים ברחבי טקסה. שני סוגים של התנהגויות ליקוט מזון זוהו בחרקים: חיפוש מזון כתוצאה מרעב וחיפוש מקומי לאחר הארוחה¹. כאשר הם רעבים, חרקים מסתמכים על רמזים חושיים כדי לאתר מקורות מזון. כאשר הם נתקלים בחלקת מזון קטנה וצורכים אותה, הם יוזמים התנהגות חיפוש מקומית המאופיינת בשבילים מפותלים ובסיבוב סביב מקום המזון.

התנהגות חיפוש באמצעות סוכר, צורה מסוימת של חיפוש מקומי, נחקרה לראשונה לפני יותר מ-60 שנה, על ידי הביולוג האמריקאי וינסנט דטייה (Dethier) בספרו Blowflies². כאשר מורעבים, זבובים מוצגים עם כמות קטנה של סוכר כך שזה לא להשביע אותם, הם מתחילים חיפוש מקומי. התנהגות חיפוש טיפוסית מאופיינת בהליכה מפותלת מאוד עם מנוע נמוך וקצב פנייה גבוה וחזרה למיקום ירידת הסוכר. מחקרים מאוחרים יותר בדקו התנהגות זו בזבובי בית וזבובי פירות ^3,4. ההתחלה, האינטנסיביות ומשך החיפוש מווסתים על ידי המצב הפנימי של בעל החיים (למשל, חסך ומוטיבציה) כמו גם גורמים חיצוניים כגון זמינות משאבים ואיכות ^1,5,6.

ההתקדמות בטכנולוגיות המעקב סיפקה לחוקרים כלים רבי ערך ללכוד ולנתח התנהגות בזירות מבוקרות. כאן, אנו מציגים פרדיגמה התנהגותית למעקב אחר זבובים ההולכים בחופשיות לאחר צריכת סוכר. מערך פשוט זה מאפשר לחקור את התנהגות החיפוש המופקת מסוכר בדרוזופילה על ידי לכידת וניתוח תנועת הזבוב בתגובה לתמיסת סוכר מרוכזת המסופקת בזירה. תוך שימוש בטכנולוגיות מעקב מתקדמות וטכניקות ניתוח נתונים, דפוסי התנועה, החקירה המרחבית ודינמיקת התגובה לגירויי סוכר כומתו בהצלחה.

באמצעות בדיקה זו, הוכח בניסוי כי החיפוש המופק מסוכר כרוך בשימוש בשילוב נתיבים וניתן להפריד אותו מרחבית-זמנית מצריכת סוכר ^7,8. יתר על כן, הוכח כי ההתנהגות יכולה להיות מופעלת על ידי הפעלת נוירוני טעם הלוע⁹. תוצאות אחרונות מראות כי גירוי סוכר אינו מנגנון שחרור מולד אלא גם אפנון, ושולט על התחלת ההתנהגות באופן זמני⁸. באמצעות פרדיגמה זו, חקרנו את ההתנהגות הזו גם בדבורי דבש (Apis mellifera)^7,8.

המטרה הסופית של מחקר זה היא לפענח מעגלים עצביים ורכיבים גנטיים חדשים המעורבים בוויסות התנהגות החיפוש באמצעות מניפולציות גנטיות ממוקדות וטכניקות דימות מוחי. התנהגויות חיפוש מזון הוכיחו את עצמן כפרדיגמות ניסוייות יעילות ביותר לחקר ניווט וזיכרון מרחבי בחרקים. התנהגויות אלה מספקות הזדמנות ייחודית לחקור את התפיסה החושית, תהליכי קבלת ההחלטות והתיאום המוטורי המעורבים בחיפוש אחר מקורות מזון מתגמלים בזבובים. בנוסף, לממצאים ממחקרים אלה יש השלכות רחבות יותר על הבנת התנהגויות אכילה באורגניזמים אחרים, כולל בני אדם, שכן מנגנונים גנטיים ועצביים בסיסיים רבים נשמרים אבולוציונית. דיסרגולציה של התנהגויות האכלה קשורה להפרעות נוירולוגיות ומטבוליות שונות¹⁰. לכן, המנגנונים העצביים והגנטיים העומדים בבסיס התנהגות החיפוש בזבובים עשויים להציע דרכים חדשות להבנה והתמודדות פוטנציאלית עם אתגרים מורכבים אלה בתחום בריאות האדם.

Protocol

זבובים זכרים בוגרים מזן הבר Drosophila melanogaster Canton-S (CS) שימשו במחקר הנוכחי.

1. הכנה ניסיונית

1. גידול זבובים
   1. אספו זבובים זכרים בוגרים המגיחים בתוך תקופה של 12 שעות ותחזקו אותם על מצע זבובים סטנדרטי (מוכן בבית) למשך 48 שעות ב-25°C עם לחות יחסית של 75% במחזור אור/חושך של 12 שעות.
      הערה: הרכב המדיה Drosophila בשימוש היה (עבור 1 ליטר של מדיה) קמח תירס (80 גרם), D-גלוקוז (20 גרם), סוכר (40 גרם), אגר (8 גרם), אבקת שמרים (15 גרם), חומצה פרופיונית (4 מ"ל), מתיל 4-הידרוקסיבנזואט (1.25 גרם ב 3 מ"ל אתנול), וחומצה אורתופוספורית (600 μL) (ראה טבלה של חומרים). תקופת ההאכלה הראשונית מבטיחה שלזבובים תהיה גישה למספיק מזון וחומרים מזינים לפני שלב הרעב. בעוד שגם זבובים זכרים וגם נקבות מעוררים את התנהגות החיפוש, זמן הרעב עקבי יותר בקרב זבובים זכרים. בנוסף, נקבות זבובים משנות את העדפת ההאכלה שלהן לאחר ההזדווגות¹¹.
2. הליך הרעבה
   1. לאחר תקופת ההאכלה, להרעיב את הזבובים של מזון אבל עם גישה למים.
      הערה: כדי לתקנן את מצב הרעב בין ניסויים וזנים, מוצע לקבוע את משך ההישרדות של 90% של האוכלוסייה בתנאים מורעבים למזון. בהתבסס על התוצאה הזו, זבובי ניתוח קיסרי הורעבו במשך 28 שעות (איור 1A) מאחר ששעון ביולוגי וגורמים אחרים יכולים להשפיע על התנהגות החיפוש¹². נמדדו גם שינויים צירקדיים בפעילויות חיפוש זבובים בשעות שונות של היום (איור 1B). שמנו לב לפעילות חיפוש יחסית מופחתת בלילה בהשוואה לשלב האור בזבובים.
   2. חשב את סובלנות הרעב מזון על ידי מניעת זבובים בני יומיים של מזון. מניחים 15-20 זבובים בבקבוקון עם נייר טישו ספוג בתחתית. זה משמש כמצע ומבטיח שלזבובים תהיה גישה למים לאורך כל תקופת הרעב.
   3. ספרו את מספר הזבובים בתקופת הרעב למזון במרווחי זמן קבועים של שעה אחת. משך הזמן שבו 90% מהזבובים המורעבים שרדו שימש כתקופת הרעב (איור 1A). השתמש במספר עותקים משוכפלים (3-4 לכל זן) כדי למזער את ההשפעה של וריאציות בודדות ולספק הערכה אמינה יותר של עמידות לרעב.
      הערה: הסבילות לרעב למזון של כל זן נקבעה על מנת לבסס מצב רעב סטנדרטי בין זנים וניסויים שונים. על ידי ספירת הזבובים ששרדו בפרקי זמן אלה, ניתן לעקוב אחר שיעור ההישרדות לאורך זמן ולקבוע כמה זמן כל זן יכול לסבול מחסור במזון לפני שהוא נכנע לרעב.
3. נוהל רישום ההתנהגות
   1. העבירו זבובים מורעבים בודדים בצינורות קטנים (איור 2A). עשו זאת בקבוצות של 5-6 זבובים כדי למזער את זמן הבידוד. על ידי בדיקת זבובים בודדים, בידוד כל זבוב, ניתן לייחס כל שינוי או פעולה שנצפו לזבוב הספציפי שנצפה, במקום להיות מושפעים מאינטראקציות עם זבובים אחרים.
   2. השתמשו בצלחות פטרי 90 מ"מ כזירה לבדיקות התנהגותיות (ניתן להשתמש בצלחות פטרי גדולות יותר. לא היה הבדל בהתנהגות בצלחות פטרי בקוטר גדול יותר). האר את הזירה מלמטה על-ידי לוח של נורות LED לבנות קרירות המותקנות על פני השטח (איור 2B,C). כדי לשמור על סביבת ראייה אחידה ולמזער הסחות דעת חיצוניות, הקיפו את זירת הניסוי בצינור פוליוויניל כלוריד לבן (גובה 51.5 מ"מ, קוטר פנימי 114 מ"מ).
      הערה: צינור זה משמש כמחסום, ומונע מגירויים חזותיים מחוץ לזירה להשפיע על התנהגות הזבוב. על ידי הפחתת הסחות דעת חיצוניות, ניתן להתמקד אך ורק באינטראקציה של הזבוב עם מקור המזון, תוך שמירה על עקביות לאורך כל הניסוי.
   3. השתמשו בעוצמת אור של 320 לוקס במרכז הזירה.
   4. מיקום 0.2 מיקרוליטר תמיסת סוכר במרכז הזירה. תמיסת סוכרוז 500 מילימטר שימשה בניסויים המדווחים, אך זה יכול להיות מגוון. הציגו את הזבוב לזירה באמצעות צינור מיקרו צנטריפוגה 2 מ"ל (קוטר פנימי 8.7 מ"מ, אורך מופחת ל -5 מ"מ על ידי מילוי כותנה בתחתית; איור 2A) מאכלס זבוב בודד הפוך מעל טיפת הסוכר.
   5. ברגע שהזבוב מתחיל לבלוע את הטיפה, הסר את מיכל הזבוב, ותן לזבוב גישה בלתי מוגבלת למקור המזון.
   6. צלם את המיקום הדו-ממדי של הזירה במצלמה עילית.
      הערה: Flea3 (אפור נקודתי, עדשת 1214 מ"מ, ראה טבלת חומרים) שימשה במחקר הנוכחי ותועדה בקצב של 40 פריימים לשנייה (fps). עם זאת, ניתן להשתמש בכל מצלמה המספקת ניגודיות טובה עם הרקע. אפשר להקליט ב 30-60 fps, בהתאם לאופי הניסוי. הקלט בפורמט .avi מכיוון שהוא תואם לתוכנת המעקב.
   7. הקלט את המשפט עד למועד בריחתו של הזבוב מהזירה. הזבובים הלכו בחופשיות ולא היה מכסה בזירה.
   8. על ידי מתן אפשרות לזבוב להחליט מתי להפסיק לחפש, לעוף משם או ללכת לשולי הזירה, שימו לב להתנהגות הטבעית של הזבוב ולאסטרטגיית חיפוש המזון שלו. נגבו את צלחות הפטרי באתנול 70% בין הניסויים וייבשו אותן לחלוטין, אחרת השתמשו בצלחת פטרי חדשה.
      הערה: חשוב לבצע את כל הניסויים בין שעתיים לשש שעות לאחר הפעלת האורות כאשר הזבובים מפגינים רמות פעילות גבוהות באופן עקבי. מסגרת זמן זו מבטיחה שהזבובים נמצאים במצב פעיל, ממקסמת את הסיכויים לצפות בהתנהגות חיפוש המזון הטבעית שלהם ומפחיתה את השפעתם של גורמים אחרים שעשויים להשפיע על התנהגותם, כגון שעון ביולוגי. המערך ההתנהגותי שכן בתוך חדר מבוקר טמפרטורה ולחות. הזירה הונחה על שולחן נטול רטט. מערך ניסויי זה כלל בידוד ובדיקה של זבובים בודדים עבור תגובתם לסוכר. טיפת סוכר סופקה לזבובים המורעבים והתנהגותם תועדה בווידיאו (איור 2B,C, וידאו 1). הניסויים נערכו במסגרת זמן מסוימת שבה הזבובים הפגינו רמות פעילות גבוהות ועקביות.
4. נתח את המסלולים לאחר שלב 2 כדי לקבוע את אופן הפעולה של החיפוש.

2. ניתוח מסלולים לחיפוש מקומי

1. נתח את הסרטונים שהוקלטו באמצעות תוכנת Ctrax¹¹ (ראה טבלת חומרים).
   הערה: התוכנה עוקבת וממירה את מיקום הזבוב בסרטון לקואורדינטות x, y, ומאפשרת מעקב וניתוח מדויקים של תנועותיו. עיין בקובץ משלים 1 לקבלת פרטים על אופן השימוש ב- Ctrax.
2. חלקו את המסלולים לשני שלבים: שלב ההזנה הראשונית ושלב החיפוש. הגדירו את סוף ההאכלה ותחילת ההליכה כזבובים הנעים במהירות >4 מ"מ ^s-1 בשלוש מסגרות רצופות.
   הערה: לאחר סיום ההאכלה, שאר המסלול שימש כתגובת החיפוש של הזבובים. מחקר זה השתמש ב- VirtualDub (ראה טבלת חומרים) כדי להסיר את שלב ההזנה מהסרטונים לפני המעקב.
3. כמת את החיפוש לפי הפרמטרים הבאים:
   1. אורך נתיב: פרמטר זה מייצג את המרחק שהלך הזבוב מנקודת ההתחלה שלו במהלך חיפוש המזון (במ"מ).
   2. זמן שהייה: הזמן שבילו הזבובים בהליכה במהלך החיפוש (ב-s). זה מציין את משך החיפוש ואת ההתמדה של הזבוב בחיפוש מזון.
   3. פיתול: חשב זאת כיחס על-ידי חלוקת קו הישר (המרחק בין הנקודה הראשונה והאחרונה של הנתיב) של הנתיב לאורך הנתיב הכולל, וחיסור מ- 1. ערכים גבוהים של פיתול מצביעים על פיתול רב יותר במסלול.
   4. מספר החזרות: השתמש באלגוריתם שפותח כדי לזהות ולספור את מספר ההחזרות באמצעות שני מעגלים קונצנטריים.
      הערה: עיגול פנימי המציין את מקור החיפוש, רין (2.5 מ"מ) והעיגול החיצוני המציין את המרחק המינימלי (4 מ"מ) שהזבוב היה צריך להתרחק מהמקור. חזרה הוגדרה כתנועה אל מחוץ למעגל החיצוני (Rout) ולאחר מכן חזרה אל תוך המעגל הפנימי (Rin).
   5. קצב פעילות: מבוטא באחוזים, חישוב קצב הפעילות על ידי קביעת הזמן במהלך חיפוש המזון כאשר מהירות ההליכה של הזבוב עולה על 2 מ"מ לשנייה. פרמטר זה משקף את רמת הפעילות והמעורבות של הזבוב בחיפוש המזון. הוא מבדיל בין לקטים פעילים לבין פרטים פחות פעילים.
      הערה: MATLAB ו- Python שימשו במחקר הנוכחי לניתוח נוסף של המסלולים. ניתן לגשת לסקריפטים כאן: https://github.com/eagermeagre/sugar_elicited_search. הליך הניתוח כולל שימוש בתוכנת Ctrax כדי לעקוב אחר תנועות הזבוב ולקבוע פרמטרים כגון משך חיפוש המזון, אורך הנתיב הכולל, זמן החיפוש, התפתלות, מספר החזרות וקצב פעילות. פרמטרים אלה מספקים תובנות חשובות לגבי התנהגות הזבוב ויעילות הליקוט במהלך ניסויי חיפוש המזון המתועדים.

Discussion

המחקר הנוכחי מציג פרדיגמה פשוטה לחקר התנהגות חיפוש הנובעת מסוכר בדרוזופילה, שתוארה לראשונה על ידי Dethier². התנהגות מולדת זו מאפשרת לזבובים לעסוק בחיפוש מקומי אחר מקורות מזון נוספים בעקבות המפגש עם פרס מזון. ההיבט המכריע ביותר של פרוטוקול הניסוי כרוך בהנעת הזבובים כראוי. ראשית, הזבובים חייבים להיות במצב של רעב, לאחר שנמנע מהם מזון ועדיין יש להם גישה למים, כדי להבטיח בליעת סוכר. על מנת לקבל את מצב הרעב האחיד לאורך ניסויים ניסיוניים, משך הזמן שבו 90% מהאוכלוסייה שורדת שימש כתקופת הרעב. באופן מכריע, השראת תגובת חיפוש לאחר האכלה מחייבת מתן גירוי מזון באיכות מספקת אך לא מספיק כדי להשביע את הזבובים באופן מלא. לכן, סטנדרטיזציה של ריכוז וכמות הסוכר, ומשך הרעב עשויה לגזול זמן רב, אך היא הכרחית להתנהגות איתנה ואמינה.

במחקר זה, תמיסת סוכרוז של 500 מילימול, 0.2 מיקרוליטר שימשה כגירוי לזבובים מורעבים. צריכת סוכר מעוררת התנהגות חיפוש מקומית אופיינית המאופיינת בהתנהגות פנייה מוגברת והחזרות תכופות למיקום טיפת הסוכר (סרטון 1). לעומת זאת, זבובים רעבים שאינם מקבלים סוכר אינם מצליחים להציג תגובת חיפוש. יש לציין כי כל הפרמטרים הקשורים להתנהגות, כולל אורך נתיב, זמן שהייה, פיתול ומספר החזרות היו נמוכים משמעותית בזבובים שלא הוזנו. הוכחנו בעבר כי בליעת מים לבדה אינה מעוררת תגובת חיפוש⁹.

מערך זה מציע גישה חסכונית ותחזוקה נמוכה לחקר התנהגות מולדת זו. בעוד שבמחקר זה נעשה שימוש בזירה עם תאורה אחורית, ניתן להשתמש גם בתאורה עליונה כל עוד יש מספיק ניגודיות בין הזבוב לרקע. תוכנת המעקב בה נעשה שימוש מסתמכת על זיהוי תנועת זבובים על רקע סטטי¹³. ניתן לכוונן את הגדרות המצלמה והרזולוציה בהתבסס על קנה המידה הספציפי של ההתנהגות הנחקרת. חשוב לציין כי מתודולוגיה זו מאפשרת לחקור מרכיבים שונים של התנהגות ליקוט מזון, כולל קשב רמז חושי במהלך ליקוט מזון, מעורבות מזון והאכלה, שליטה מוטורית בחיפוש, ותהליכי קבלת החלטות הקשורים לניצול וחקירה, בין היתר. יתר על כן, פרדיגמה זו מאפשרת חקירה של חיפוש מקומי, התנהגות הנפוצה על פני טקסים מגוונים בהקשרים אקולוגיים שונים⁶. חקר התנהגות זו בדרוזופילה, פותח אפיקים לחקירה מדעית שמטרתה להבין את המסלולים העצביים המעורבים בליקוט מזון. חקרנו חיפוש מקומי בדבורי דבש והראינו שההתנהגות דומה לזבובים ^7,8.

מחקרים אחרונים הראו כי התנהגות חיפוש מקומית יכולה להיות מופעלת על ידי הפעלה אופטוגנטית של נוירונים חושי סוכר שונים בזבובים 14,15,16. עם זאת, עדיין לא ברור באיזו מידה החיפושים המקומיים שנצפו במחקרים אלה מייצגים במדויק את ההתנהגות הטבעית של זבובים בתגובה לצריכת סוכר בפועל. התנהגות ההאכלה מווסתת היטב בזבובים, וממצאים אלה מצביעים על כך שהפעלת קולטני הסוכר בלוע יוזמת את התנהגות החיפוש. חושי טעם טרסליים אחראים על גילוי סוכר וגרימת רפלקס הארכת החוטם, בעוד נוירוני טעם הלוע קובעים אם האכלה צריכה להמשיך^17,18. לאחר בליעתה, תמיסת הסוכר עוברת דרך הוושט אל הפרובנסטריקולוס ונכנסת ליבול, כאשר התפשטותה מנוטרת על ידי עצב חוזר¹⁹. בנוסף, ראוי לציין כי חלק מהמחקרים הנ"ל עסקו ברתימה או כליאה של זבובים, בעוד ששיטה זו מאפשרת לבעלי החיים ללכת בחופשיות לאורך כל הניסוי. לזבובים בניסויים שלנו הייתה מוטיבציה מספקת להישאר ולחפש בתוך הזירה ללא הטלת מכסה.

הבנת יחסי הגומלין המורכבים בין מסלולים עצביים, גורמים גנטיים ורמזים סביבתיים השולטים בהתנהגות החיפוש בזבובים יכולה לשפוך אור על העקרונות הבסיסיים של עיבוד מידע, למידה ויצירת זיכרון. יתר על כן, חוסר ויסות של התנהגות ליקוט מזון היה מעורב בהפרעות אנושיות שונות, כולל הפרעות אכילה והשמנת יתר. המערך הנרחב של כלים נוירוגנטיים הזמינים בדרוזופילה מספק משאב רב ערך לחקר התנהגות החיפוש הנובעת מסוכר ולפענוח המנגנונים העצביים והגנטיים העומדים בבסיס ליקוט מזון. בשילוב עם מניפולציה אופטוגנטית ודימות פונקציונלי, פרדיגמה זו מציגה גישה חזקה ומבטיחה^20,21,22. עם זאת, שינוי ההגדרה למניפולציה בזמן אמת של פעילות עצבית עם אופטוגנטיקה עשוי להיות מאתגר. כדי לנטר את הפעילות העצבית במוח בזמן שזבוב מבצע את התנהגות החיפוש, יהיה צורך במערך אחר, כמו הזבוב הקשור על כדור דריכה. היבטים רבים של התנהגות ליקוט מזון, כגון ויסות האכלה ותהליכי קבלת החלטות, נשמרים מאוד בין מינים שונים. לכן, תובנות המתקבלות מחקירת המנגנונים העצביים של ליקוט מזון בזבובים יכולות לספק תובנות חשובות על תהליכים דומים באורגניזמים אחרים, כולל בני אדם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Eppendorf tube	Sigma Aldrich	BR780546	Used to introduce the fly to the sugar drop
Agar	SRL	9002-18-0
Azure lens	https://www.rmaelectronics.com/azure-photonics-azure-1214mm/
Camera	Logicool, Japan
Corn flour	locally available
Ctrax software	https://ctrax.sourceforge.net/
D-glucose	SRL	50-99-7
Flea3	Sony		https://www.flir.com/products/flea3-usb3/?vertical=machine+vision&segment=iis
glass tube	Borosil		Used to house the flies individually
Kimwipe	Kimberly-Clark	34155	Used to provide access to water for flies during food starvation
LED light panel			custom-made in the workshop
Light Meter	TENMARS	TM-203
Methyl 4-hydroxybenzoate	Fisher Scientific	99-76-3
Orthophosphotic acid	SRL	7664-38-2
Petri dish (90 mm)	Tarsons	460090
Propionic acid	SRL	79-09-4
Sucrose	Qualigens	Q28105
Sugar	locally available
VirtualDub	https://www.virtualdub.org/
White polyvinyl chloride pipe (67 mm inner diameter × 100 mm height)			custom-made in the workshop
Yeast powder	SRL	REF-34266