מדידת שינויים בשלמות מחסום האנדותל במוח באמצעות שני חיישנים ביולוגיים מבוססי עכבה בתגובה לתאים סרטניים וציטוקינים

Summary

כאן אנו מדגימים את הטכניקה של שימוש בחיישנים ביולוגיים מבוססי עכבה: ECIS ו- cellZscope, למדידת חוזק מחסום אנדותל במוח. אנו מפרטים את ההכנה והטכניקה של הוספת גירויים שונים למודל in vitro של אנדותל המוח. אנו מודדים, רושמים ונותנים ניתוח מייצג של הממצאים.

Abstract

מחסום הדם-מוח (BBB) מגן על פרנכימה במוח מפני פתוגנים מזיקים בדם. BBB מורכב מהיחידה הנוירו-וסקולרית, הכוללת פריציטים, תהליכים אסטרוציטיים ברגל ותאי אנדותל צמודים. כאן, תאי האנדותל במוח מהווים את קו המחסום הראשון מפני פתוגנים הנישאים בדם. במצבים כמו סרטן ודלקת עצבית, גורמים במחזור הדם יכולים לשבש את המחסום הזה. התקדמות המחלה מחמירה באופן משמעותי לאחר הפרעה במחסום, המאפשרת גישה או פגיעה באזורים במוח. זה מחמיר באופן משמעותי את הפרוגנוזות, במיוחד בשל אפשרויות טיפול מוגבלות הזמינות ברמת המוח. לפיכך, מחקרים חדשים שואפים לחקור טיפולים פוטנציאליים שיכולים למנוע מגורמים מזיקים אלה בדם אינטראקציה עם תאי האנדותל במוח.

מכשירי ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) ומכשירי CellZscope הזמינים מסחרית מודדים את העכבה על פני חד-שכבות תאיות כגון אנדותל BBB, כדי לקבוע את חוזק המחסום שלהן. כאן אנו מפרטים את השימוש בשני הביו-חיישנים בהערכת שלמות מחסום האנדותל במוח עם הוספת גירויים שונים. באופן מכריע, אנו מדגישים את החשיבות של יכולת התפוקה הגבוהה שלהם לחקירה בו זמנית של משתנים מרובים וטיפולים ביולוגיים.

Introduction

מאמר זה דן במגמות הנוכחיות בהערכת תאים מיקרו-וסקולריים. אנו מפרטים באופן ספציפי את השימוש בשתי פלטפורמות זמינות מסחרית למדידת תכונות המחסום של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מוחיים. תאי אנדותל הם תאים הפונים לדם, המרפדים את דופן כלי הדם. עם זאת, כלי דם מוחיים הם ייחודיים מכיוון שהם עוזרים ליצור את מחסום הדם-מוח המגן (BBB)^1,2,3. ה-BBB פועל לווסת את העברת המולקולות מהדם למוח. מחלות היקפיות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית (CNS) קשורות בדרך כלל לכשל תפקודי של BBB ^4,5. המבנים האנטומיים היוצרים את BBB אינם נוכחים בממשק רקמת הד....

Protocol

1. שימוש ב-ECIS לניטור שינויים בשלמות מחסום האנדותל במוח בתגובה לטיפולים שונים

1. הגדרת התוכנה, תחנת המערך והמכונה
   1. חבר את תחנת מערך 96 הקידוחים למכשיר. הניחו את עמדת המערך בשקית ניילון והניחו אותה באינקובטור לפחות שעה לפני הבדיקה כדי לאפשר לה להתחמם. הסירו את שקית הניילון מ.......

Discussion

מחקרים טיפוליים על מחלות המשפיעות על BBB חייבים לקחת בחשבון את החשיבות של מחסום אנדותל במוח, שלמות וויסות. לדוגמה, הפרעה במחסום האנדותל במוח נחקרת באופן קריטי בגרורות של סרטן למוח מאתרים אנטומיים אחרים. הסיבה לכך היא שהאנדותל במוח מהווה את המחסום הראשון נגד תאי הגידול במחזור. כפי שהוזכר קוד.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
aMEM	Gibco	12561072	Melanoma cell base media
cellZscope array	nanoAnalytics	cellZscope2; software v4.3.1	TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tail	Gibco	A1048301	ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Brain endothelial media supplement
ECIS array	Applied Biophysics	ECIS ZΘ; software v1.2.163.0	Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate	Applied Biophysics	96W20idf	96-well biosensor plate
FBS	Sigma-Aldrich	12203C-500ML
GlutaMAX	Gibco	305050-061	Brain endothelial media supplement
hCMVEC	Applied Biological Materials	T0259	Brain endothelial cell line
hEGF	PeproTech	PTAF10015100	Brain endothelial media supplement
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3393	Brain endothelial media supplement
hFGF	PeproTech	PTAF10018B50	Brain endothelial media supplement
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Brain endothelial media supplement
IL-1β	PeproTech	200-01B	Cytokine
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	11074547001	Melanoma cell media supplement
M199	Gibco	11150-067	Brain endothelial cell base media
MilliQ water			Deionized water
PBS 1x	Gibco	10010-023
TNFα	PeproTech	300-01A	Cytokine
Transwell insert	Corning	CLS3464	Porous membrane insert
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Dissociation reagent