Medindo mudanças na integridade da barreira endotelial cerebral com dois biossensores baseados em impedância em resposta a células cancerígenas e citocinas

Summary

Aqui demonstramos a técnica de uso de biossensores baseados em impedância: ECIS e cellZscope, para medir a força da barreira endotelial cerebral. Detalhamos a preparação e a técnica de adição de vários estímulos a um modelo in vitro do endotélio cerebral. Medimos, registramos e fornecemos uma análise representativa dos resultados.

Abstract

A barreira hematoencefálica (BHE) protege o parênquima cerebral contra patógenos nocivos no sangue. A BHE consiste na unidade neurovascular, compreendendo pericitos, processos astrocíticos do pé e células endoteliais fortemente aderidas. Aqui, as células endoteliais do cérebro formam a primeira linha de barreira contra patógenos transmitidos pelo sangue. Em condições como câncer e neuroinflamação, fatores circulantes no sangue podem romper essa barreira. A progressão da doença piora significativamente após a ruptura da barreira, o que permite o acesso ou comprometimento de regiões do cérebro. Isso piora significativamente os prognósticos, principalmente devido às opções limitadas de tratamento disponíveis no nível do cérebro. Assim, estudos emergentes visam investigar potenciais terapêuticas que podem impedir que esses fatores prejudiciais no sangue interajam com as células endoteliais do cérebro.

Os instrumentos Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) e cellZscope disponíveis comercialmente medem a impedância através de monocamadas celulares, como o endotélio BBB, para determinar sua força de barreira. Aqui detalhamos o uso de ambos os biossensores na avaliação da integridade da barreira endotelial cerebral após a adição de vários estímulos. Crucialmente, destacamos a importância de sua capacidade de alto rendimento para investigação simultânea de múltiplas variáveis e tratamentos biológicos.

Introduction

Este artigo discute as tendências atuais na avaliação de células microvasculares. Detalhamos especificamente o uso de duas plataformas comercialmente disponíveis para medir as propriedades de barreira das células endoteliais microvasculares cerebrais. As células endoteliais são células voltadas para o sangue, que revestem a parede do vaso. No entanto, os microvasos cerebrais são únicos, pois ajudam a formar a barreira hematoencefálica protetora (BHE)^1,2,3. O BBB funciona para regular o transporte de moléculas do sangue para o cérebro. As doenças periféricas que acometem o sis....

Protocol

1. Usando ECIS para monitorar mudanças na integridade da barreira endotelial cerebral em resposta a vários tratamentos

1. Configurando o software, a estação de matriz e a máquina
   1. Conecte a estação de matriz de 96 poços à máquina. Coloque a estação de matriz em um saco plástico e coloque-a na incubadora pelo menos 1 h antes do ensaio para permitir que ela aqueça. Remova o saco plástico imediatamente antes do experimento.
   2. Quando estiver pronto, ligue a máquin.......

Discussion

Estudos terapêuticos sobre doenças que acometem a BHE devem considerar a importância da integridade e regulação da barreira endotelial cerebral. Por exemplo, a ruptura da barreira endotelial cerebral é criticamente investigada na metástase do câncer para o cérebro a partir de outros locais anatômicos. Isso ocorre porque o endotélio cerebral forma a primeira barreira contra as células tumorais circulantes. Como mencionado anteriormente na introdução, os estudos in vitro sobre a integridade da barrei.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
aMEM	Gibco	12561072	Melanoma cell base media
cellZscope array	nanoAnalytics	cellZscope2; software v4.3.1	TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tail	Gibco	A1048301	ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Brain endothelial media supplement
ECIS array	Applied Biophysics	ECIS ZΘ; software v1.2.163.0	Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate	Applied Biophysics	96W20idf	96-well biosensor plate
FBS	Sigma-Aldrich	12203C-500ML
GlutaMAX	Gibco	305050-061	Brain endothelial media supplement
hCMVEC	Applied Biological Materials	T0259	Brain endothelial cell line
hEGF	PeproTech	PTAF10015100	Brain endothelial media supplement
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3393	Brain endothelial media supplement
hFGF	PeproTech	PTAF10018B50	Brain endothelial media supplement
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Brain endothelial media supplement
IL-1β	PeproTech	200-01B	Cytokine
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	11074547001	Melanoma cell media supplement
M199	Gibco	11150-067	Brain endothelial cell base media
MilliQ water			Deionized water
PBS 1x	Gibco	10010-023
TNFα	PeproTech	300-01A	Cytokine
Transwell insert	Corning	CLS3464	Porous membrane insert
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Dissociation reagent