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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui demonstramos a técnica de uso de biossensores baseados em impedância: ECIS e cellZscope, para medir a força da barreira endotelial cerebral. Detalhamos a preparação e a técnica de adição de vários estímulos a um modelo in vitro do endotélio cerebral. Medimos, registramos e fornecemos uma análise representativa dos resultados.

Abstract

A barreira hematoencefálica (BHE) protege o parênquima cerebral contra patógenos nocivos no sangue. A BHE consiste na unidade neurovascular, compreendendo pericitos, processos astrocíticos do pé e células endoteliais fortemente aderidas. Aqui, as células endoteliais do cérebro formam a primeira linha de barreira contra patógenos transmitidos pelo sangue. Em condições como câncer e neuroinflamação, fatores circulantes no sangue podem romper essa barreira. A progressão da doença piora significativamente após a ruptura da barreira, o que permite o acesso ou comprometimento de regiões do cérebro. Isso piora significativamente os prognósticos, principalmente devido às opções limitadas de tratamento disponíveis no nível do cérebro. Assim, estudos emergentes visam investigar potenciais terapêuticas que podem impedir que esses fatores prejudiciais no sangue interajam com as células endoteliais do cérebro.

Os instrumentos Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) e cellZscope disponíveis comercialmente medem a impedância através de monocamadas celulares, como o endotélio BBB, para determinar sua força de barreira. Aqui detalhamos o uso de ambos os biossensores na avaliação da integridade da barreira endotelial cerebral após a adição de vários estímulos. Crucialmente, destacamos a importância de sua capacidade de alto rendimento para investigação simultânea de múltiplas variáveis e tratamentos biológicos.

Introduction

Este artigo discute as tendências atuais na avaliação de células microvasculares. Detalhamos especificamente o uso de duas plataformas comercialmente disponíveis para medir as propriedades de barreira das células endoteliais microvasculares cerebrais. As células endoteliais são células voltadas para o sangue, que revestem a parede do vaso. No entanto, os microvasos cerebrais são únicos, pois ajudam a formar a barreira hematoencefálica protetora (BHE)1,2,3. O BBB funciona para regular o transporte de moléculas do sangue para o cérebro. As doenças periféricas que acometem o sis....

Protocol

1. Usando ECIS para monitorar mudanças na integridade da barreira endotelial cerebral em resposta a vários tratamentos

  1. Configurando o software, a estação de matriz e a máquina
    1. Conecte a estação de matriz de 96 poços à máquina. Coloque a estação de matriz em um saco plástico e coloque-a na incubadora pelo menos 1 h antes do ensaio para permitir que ela aqueça. Remova o saco plástico imediatamente antes do experimento.
    2. Quando estiver pronto, ligue a máquin.......

Representative Results

Interpretando dados de impedância ECIS

Entendendo as condições experimentais ideais
Aqui, os dados podem ser visualizados diretamente usando o software (Figura 2A) ou exportados para análise e plotagem gráfica (Figura 2B). A Figura 2A mostra um exemplo de dados exibidos na interface de software real. O gráfico à esquerda mostra um exemplo de uma conexão .......

Discussion

Estudos terapêuticos sobre doenças que acometem a BHE devem considerar a importância da integridade e regulação da barreira endotelial cerebral. Por exemplo, a ruptura da barreira endotelial cerebral é criticamente investigada na metástase do câncer para o cérebro a partir de outros locais anatômicos. Isso ocorre porque o endotélio cerebral forma a primeira barreira contra as células tumorais circulantes. Como mencionado anteriormente na introdução, os estudos in vitro sobre a integridade da barrei.......

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgements

Akshata Anchan foi financiado pela Fundação Neurológica da Nova Zelândia para a Gillespie Scholarship (referência da concessão: 1628-GS) e First Fellowship (referência da concessão: 2021 FFE). O custo da pesquisa também foi parcialmente financiado pela Neurological Foundation Fellowship-2021 FFE e pelo Fundo de Desenvolvimento de Pesquisa do Corpo Docente da Universidade de Auckland. James Hucklesby foi financiado por uma bolsa de estudos da Auckland Medical Research Foundation. Obrigado à equipe de Baguley e ao Centro de Pesquisa da Sociedade do Câncer de Auckland pelas linhas celulares NZM de melanoma da Nova Zelândia derivadas de pacientes.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
aMEMGibco12561072Melanoma cell base media
cellZscope arraynanoAnalyticscellZscope2; software v4.3.1TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tailGibcoA1048301ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMPSigma-AldrichD0627Brain endothelial media supplement
ECIS array Applied BiophysicsECIS ZΘ; software v1.2.163.0Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate Applied Biophysics96W20idf 96-well biosensor plate
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Brain endothelial media supplement
hCMVECApplied Biological MaterialsT0259Brain endothelial cell line
hEGFPeproTechPTAF10015100Brain endothelial media supplement
HeparinSigma-AldrichH-3393Brain endothelial media supplement
hFGFPeproTechPTAF10018B50Brain endothelial media supplement
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Brain endothelial media supplement
IL-1βPeproTech200-01BCytokine
Insulin-Transferrin-Sodium SeleniteSigma-Aldrich11074547001Melanoma cell media supplement
M199Gibco11150-067Brain endothelial cell base media
MilliQ waterDeionized water
PBS 1xGibco10010-023
TNFαPeproTech300-01ACytokine
Transwell insertCorningCLS3464Porous membrane insert
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Dissociation reagent

References

  1. Fidler, I. J., Schackert, G., Zhang, R. D., Radinsky, R., Fujimaki, T. The biology of melanoma brain metastasis. Cancer Metastasis Reviews. 18 (3), 387-400 (1999).
  2. Tomlinson, E. Theory and practice of site-specific drug delivery.

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Keywords Barreira hematoencef licaBHEC lulas endoteliaisUnidade neurovascularPerectosAstr citosC ncerNeuroinflama oCitocinasBiossensores baseados em imped nciaECISCellZscopeIntegridade da barreiraAlto rendimentoMonocamada celular

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