Измерение изменений целостности эндотелиального барьера головного мозга с помощью двух биосенсоров на основе импеданса в ответ на раковые клетки и цитокины

Summary

В данной работе мы демонстрируем методику использования биосенсоров на основе импеданса: ECIS и cellZscope для измерения прочности эндотелиального барьера головного мозга. Мы подробно описываем подготовку и технику добавления различных стимулов в модель эндотелия головного мозга in vitro . Мы измеряем, записываем и проводим репрезентативный анализ полученных результатов.

Abstract

Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) защищает паренхиму мозга от вредных патогенов в крови. ГЭБ состоит из нервно-сосудистой единицы, состоящей из перицитов, астроцитарных отростков стопы и плотно прилегающих эндотелиальных клеток. Здесь эндотелиальные клетки мозга образуют первую линию барьера против патогенов, передающихся через кровь. При таких состояниях, как рак и нейровоспаление, циркулирующие факторы в крови могут нарушить этот барьер. Прогрессирование заболевания значительно ухудшается после разрушения барьера, которое обеспечивает доступ к областям мозга или их нарушение. Это значительно ухудшает прогнозы, особенно из-за ограниченных вариантов лечения, доступных на уровне мозга. Следовательно, новые исследования направлены на изучение потенциальных терапевтических средств, которые могут предотвратить взаимодействие этих вредных факторов в крови с эндотелиальными клетками мозга.

Коммерчески доступные приборы Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS) и cellZscope измеряют импеданс на клеточных монослоях, таких как эндотелий BBB, чтобы определить их барьерную прочность. В данной статье мы подробно описываем использование обоих биосенсоров для оценки целостности эндотелиального барьера мозга при добавлении различных стимулов. Важно отметить, что мы подчеркиваем важность их высокой пропускной способности для параллельного исследования нескольких переменных и биологических методов лечения.

Introduction

В данной статье рассматриваются современные тенденции в оценке микрососудистых клеток. В частности, подробно описывается использование двух коммерчески доступных платформ для измерения барьерных свойств клеток микрососудистого эндотелия головного мозга. Эндотелиальные клетки – это клетки, обращенные к крови, которые выстилают стенку сосуда. Тем не менее, микрососуды головного мозга уникальны, поскольку они помогают формировать защитный гематоэнцефалический барьер (ГЭБ)^1,2,3. ГЭБ функционирует для регулирования транспортировки молекул из крови в мозг. Периферические заболевани....

Protocol

1. Использование ECIS для мониторинга изменений целостности эндотелиального барьера головного мозга в ответ на различные методы лечения

1. Настройка программного обеспечения, массивной станции и машины
   1. Подключите к машине 96-луночную матрицу. Поместите матрицу в поли.......

Discussion

Терапевтические исследования заболеваний, влияющих на ГЭБ, должны учитывать важность целостности и регуляции эндотелиального барьера мозга. Например, нарушение эндотелиального барьера мозга критически исследуется при метастазировании рака в мозг из других анатомических участков. Э.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
aMEM	Gibco	12561072	Melanoma cell base media
cellZscope array	nanoAnalytics	cellZscope2; software v4.3.1	TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tail	Gibco	A1048301	ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMP	Sigma-Aldrich	D0627	Brain endothelial media supplement
ECIS array	Applied Biophysics	ECIS ZΘ; software v1.2.163.0	Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate	Applied Biophysics	96W20idf	96-well biosensor plate
FBS	Sigma-Aldrich	12203C-500ML
GlutaMAX	Gibco	305050-061	Brain endothelial media supplement
hCMVEC	Applied Biological Materials	T0259	Brain endothelial cell line
hEGF	PeproTech	PTAF10015100	Brain endothelial media supplement
Heparin	Sigma-Aldrich	H-3393	Brain endothelial media supplement
hFGF	PeproTech	PTAF10018B50	Brain endothelial media supplement
Hydrocortison	Sigma-Aldrich	H0888	Brain endothelial media supplement
IL-1β	PeproTech	200-01B	Cytokine
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	11074547001	Melanoma cell media supplement
M199	Gibco	11150-067	Brain endothelial cell base media
MilliQ water			Deionized water
PBS 1x	Gibco	10010-023
TNFα	PeproTech	300-01A	Cytokine
Transwell insert	Corning	CLS3464	Porous membrane insert
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12604021	Dissociation reagent