A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך שלב אחר שלב לניקוי אופטי מהיר ובו-זמני, תיוג מוטי עגול ושחזור נפחי תלת-ממדי של עשרות קטעי מוח אנושיים לאחר המוות על ידי שילוב (SWITCH - H 2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) טכניקת טרנספורמציה קצרה של רקמות עם הדמיה במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בפרוטוקול תפוקה גבוהה באופן שגרתי.
למרות טכניקות הניקוי הרבות שהתפתחו בעשור האחרון, עיבוד מוחות אנושיים לאחר המוות נותר משימה מאתגרת בשל ממדיו ומורכבותו, המקשים במיוחד על הדמיה ברזולוציה מיקרומטרית. מאמר זה מציג פרוטוקול לביצוע שחזור חלקים נפחיים של המוח האנושי על ידי עיבוד סימולטני של עשרות מקטעים עם פרוטוקול טרנספורמציית רקמות קצר (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), המאפשר ניקוי, תיוג והדמיה רציפה של הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור (LSFM). SHORT מספק ניקוי רקמות מהיר ותיוג הומוגני של פרוסות עבות עם מספר סמנים עצביים, המאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות עצביות שונות הן בחומר הלבן והן בחומר האפור. לאחר הניקוי, הפרוסות מצולמות באמצעות LSFM ברזולוציה מיקרומטרית ובמספר ערוצים בו זמנית לשחזור תלת ממדי מהיר. על ידי שילוב של SHORT עם ניתוח LSFM בתוך פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה באופן שגרתי, ניתן לקבל שחזור ציטוארכיטקטורה תלת ממדי של אזורים נפחיים גדולים ברזולוציה גבוהה בזמן קצר, ובכך לאפשר אפיון מבני מקיף של המוח האנושי.
ניתוח הארגון המולקולרי התלת-ממדי והציטוארכיטקטורה של נפחים גדולים של המוח האנושי דורש שקיפות אופטית של דגימות, המושגת באמצעות פרוטוקולים בעלי זמן עיבוד נרחב. טכניקות ניקוי אופטי פותחו כדי למזער את ההטרוגניות באינדקס השבירה (RI) בתוך הרקמות, ובכך להפחית את פיזור האור ולהגדיל את עומק חדירת האור עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה 1,2,3,4,5. ההתקדמות הנוכחית בשיטות ניקוי ותיוג רקמות עמוק מאפשרות הדמיה נפחית של איברי מכרסמים ועוברים שלמים על ידי שימוש בטכניקות מיקרוסקופיה מתקדמות 6,7,8....
דגימות רקמה אנושית מקובעת פורמלין סופקו על ידי המחלקה לנוירופתולוגיה בשירות הנתיחה שלאחר המוות של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (MGH) (בוסטון, ארה"ב). הסכמה בכתב התקבלה ממשתתפים בריאים לפני המוות, בהתאם לפרוטוקולי איסוף רקמות שאושרו על ידי IRB מהוועדה לבטיחות ביולוגית מוסדית של השותפים (PIBC, protoc.......
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר טיפול סימולטני במספר פרוסות, בעובי הנע בין 100 מיקרומטר ל-500 מיקרומטר, בשיטת SHORT. גישה זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן העיבוד הכולל של ההליך כולו. בעבודה זו אנו מספקים תיאור מקיף של כל הצינור (איור 1) לעיבוד מקטעים עבים מרובים במוח האנושי לאחר המוות בו .......
הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור תלת-ממדי של אזורי מוח אנושיים גדולים דורשים חתך רקמות מכני ואחריו ניקוי אופטי ותיוג חיסוני של פרוסות בודדות. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר כיצד ניתן להשתמש בשיטת טרנספורמציית רקמות SHORT לעיבוד מהיר ובו-זמני של מקטעים עבים מרובים במוח האנושי לשחזור מוח תלת-ממדי ברזו.......
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.
אנו מודים לברוס פישל, בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, מרכז א.א. מרטינוס לדימות ביו-רפואי, המחלקה לרדיולוגיה, על אספקת דגימות המוח האנושי שנותחו במחקר זה. פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית מסגרת המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי תחת הסכם מענק מס '654148 (Laserlab-Europe), מתוכנית המסגרת Horizon 2020 של האיחוד האירופי למחקר וחדשנות במסגרת הסכם המענק הספציפי מס '785907 (פרויקט המוח האנושי SGA2) ומס '945539 (פרויקט המוח האנושי SGA3), ממרכז תאגיד בית החולים הכללי של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר U01 MH117023, וממשרד החינוך האיטלקי במסגרת Euro-Bioimaging Italian Node (תשתית מחקר ESFRI). לבסוף, מחקר זה בוצע בתרומת "Fondazione CR Firenze". התוכן של עבודה זו הוא ....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
Coverslips | LaserOptex | / | customized |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
Spacers | Microlaser srl | customized | |
Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
Antibodies and Dyes | |||
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved