ניקוי אופטי ותיוג עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בדימות מוח אנושי בקנה מידה גדול

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך שלב אחר שלב לניקוי אופטי מהיר ובו-זמני, תיוג מוטי עגול ושחזור נפחי תלת-ממדי של עשרות קטעי מוח אנושיים לאחר המוות על ידי שילוב (SWITCH - _{H 2}O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) טכניקת טרנספורמציה קצרה של רקמות עם הדמיה במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בפרוטוקול תפוקה גבוהה באופן שגרתי.

Abstract

למרות טכניקות הניקוי הרבות שהתפתחו בעשור האחרון, עיבוד מוחות אנושיים לאחר המוות נותר משימה מאתגרת בשל ממדיו ומורכבותו, המקשים במיוחד על הדמיה ברזולוציה מיקרומטרית. מאמר זה מציג פרוטוקול לביצוע שחזור חלקים נפחיים של המוח האנושי על ידי עיבוד סימולטני של עשרות מקטעים עם פרוטוקול טרנספורמציית רקמות קצר (SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), המאפשר ניקוי, תיוג והדמיה רציפה של הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור (LSFM). SHORT מספק ניקוי רקמות מהיר ותיוג הומוגני של פרוסות עבות עם מספר סמנים עצביים, המאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות עצביות שונות הן בחומר הלבן והן בחומר האפור. לאחר הניקוי, הפרוסות מצולמות באמצעות LSFM ברזולוציה מיקרומטרית ובמספר ערוצים בו זמנית לשחזור תלת ממדי מהיר. על ידי שילוב של SHORT עם ניתוח LSFM בתוך פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה באופן שגרתי, ניתן לקבל שחזור ציטוארכיטקטורה תלת ממדי של אזורים נפחיים גדולים ברזולוציה גבוהה בזמן קצר, ובכך לאפשר אפיון מבני מקיף של המוח האנושי.

Introduction

ניתוח הארגון המולקולרי התלת-ממדי והציטוארכיטקטורה של נפחים גדולים של המוח האנושי דורש שקיפות אופטית של דגימות, המושגת באמצעות פרוטוקולים בעלי זמן עיבוד נרחב. טכניקות ניקוי אופטי פותחו כדי למזער את ההטרוגניות באינדקס השבירה (RI) בתוך הרקמות, ובכך להפחית את פיזור האור ולהגדיל את עומק חדירת האור עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה 1,2,3,4,5. ההתקדמות הנוכחית בשיטות ניקוי ותיוג רקמות עמוק מאפשרות הדמיה נפחית של איברי מכרסמים ועוברים שלמים על ידי שימוש בטכניקות מיקרוסקופיה מתקדמות 6,7,8....

Protocol

דגימות רקמה אנושית מקובעת פורמלין סופקו על ידי המחלקה לנוירופתולוגיה בשירות הנתיחה שלאחר המוות של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס (MGH) (בוסטון, ארה"ב). הסכמה בכתב התקבלה ממשתתפים בריאים לפני המוות, בהתאם לפרוטוקולי איסוף רקמות שאושרו על ידי IRB מהוועדה לבטיחות ביולוגית מוסדית של השותפים (PIBC, protoc.......

Discussion

הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור תלת-ממדי של אזורי מוח אנושיים גדולים דורשים חתך רקמות מכני ואחריו ניקוי אופטי ותיוג חיסוני של פרוסות בודדות. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר כיצד ניתן להשתמש בשיטת טרנספורמציית רקמות SHORT לעיבוד מהיר ובו-זמני של מקטעים עבים מרובים במוח האנושי לשחזור מוח תלת-ממדי ברזו.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200