Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala

Summary

Il presente protocollo fornisce una procedura passo-passo per la clearing ottica rapida e simultanea, la marcatura multi-round e la ricostruzione volumetrica 3D di decine di sezioni di cervello umano post-mortem combinando la tecnica di trasformazione tissutale corta (SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) SHORT con l'imaging al microscopio a fluorescenza a foglio luminoso in un protocollo di routine ad alto rendimento.

Abstract

Nonostante le numerose tecniche di clearing emerse nell'ultimo decennio, l'elaborazione post-mortem del cervello umano rimane un compito impegnativo a causa delle sue dimensioni e complessità, che rendono particolarmente difficile l'imaging con risoluzione micrometrica. Questo articolo presenta un protocollo per eseguire la ricostruzione di porzioni volumetriche del cervello umano elaborando simultaneamente decine di sezioni con il protocollo di trasformazione tissutale SHORT (SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), che consente la clearing, la marcatura e l'imaging sequenziale dei campioni con microscopia a fluorescenza a foglio di luce (LSFM). SHORT fornisce una rapida pulizia dei tessuti e una marcatura multipla omogenea di fette spesse con diversi marcatori neuronali, consentendo l'identificazione di diverse sottopopolazioni neuronali sia nella materia bianca che in quella grigia. Dopo la pulizia, le fette vengono visualizzate tramite LSFM con risoluzione micrometrica e in più canali contemporaneamente per una rapida ricostruzione 3D. Combinando l'analisi SHORT con LSFM all'interno di un protocollo di routine ad alto rendimento, è possibile ottenere la ricostruzione della citoarchitettura 3D di grandi aree volumetriche ad alta risoluzione in breve tempo, consentendo così una caratterizzazione strutturale completa del cervello umano.

Introduction

L'analisi dell'organizzazione molecolare 3D e della citoarchitettura di grandi volumi del cervello umano richiede la trasparenza ottica dei campioni, ottenuta attraverso protocolli con tempi di elaborazione estesi. Le tecniche di compensazione ottica sono state sviluppate per ridurre al minimo l'eterogeneità dell'indice di rifrazione (RI) all'interno dei tessuti, riducendo così la dispersione della luce e aumentando la profondità di penetrazione della luce per l'imaging ad alta risoluzione 1,2,3,4,5. Gli at....

Protocol

Campioni di tessuto umano fissati in formalina sono stati forniti dal Dipartimento di Neuropatologia del Massachusetts General Hospital (MGH) Autopsy Service (Boston, USA). Il consenso scritto è stato ottenuto dai partecipanti sani prima della morte, seguendo i protocolli di raccolta dei tessuti approvati dall'IRB dal Comitato Istituzionale per la Biosicurezza dei Partner (PIBC, protocollo 2003P001937). I documenti di autorizzazione sono conservati presso il MGH Autopsy Services di Boston, MA, Stati Uniti, e sono dispon.......

Discussion

L'imaging ad alta risoluzione e la ricostruzione 3D di grandi aree cerebrali umane richiedono il sezionamento meccanico dei tessuti, seguito dalla pulizia ottica e dall'immunomarcatura di singole fette. Il protocollo qui presentato descrive come il metodo di trasformazione tissutale SHORT può essere utilizzato per l'elaborazione rapida e simultanea di più sezioni spesse del cervello umano per la ricostruzione cerebrale 3D con una risoluzione subcellulare con LSFM.

A differenza di altri appro.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200