Оптическая очистка и маркировка для световой флуоресцентной микроскопии при крупномасштабной визуализации головного мозга человека

Summary

Настоящий протокол обеспечивает пошаговую процедуру быстрой и одновременной оптической очистки, многократного мечения и объемной 3D-реконструкции десятков посмертных срезов мозга человека путем комбинирования (SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-тиодиэтанол [TDE]) короткого метода трансформации тканей с визуализацией флуоресцентной микроскопии со световым листом в стандартном протоколе с высокой пропускной способностью.

Abstract

Несмотря на многочисленные методы очистки, появившиеся в последнее десятилетие, обработка посмертного человеческого мозга остается сложной задачей из-за его размеров и сложности, которые делают визуализацию с микрометровым разрешением особенно сложной. В данной работе представлен протокол реконструкции объемных участков головного мозга человека путем одновременной обработки десятков срезов протоколом тканевой трансформации SHORT (SWITCH - H₂O₂ - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]), который позволяет очищать, маркировать и последовательно визуализировать образцы с помощью световой флуоресцентной микроскопии (LSFM). SHORT обеспечивает быстрое очищение тканей и однородное множественное мечение толстых срезов несколькими нейрональными маркерами, что позволяет идентифицировать различные субпопуляции нейронов как в белом, так и в сером веществе. После очистки срезы визуализируются с помощью LSFM с микрометровым разрешением и по нескольким каналам одновременно для быстрой 3D-реконструкции. Комбинируя SHORT с LSFM-анализом в рамках протокола с высокой пропускной способностью, можно получить 3D-реконструкцию цитоархитектуры больших объемных областей с высоким разрешением за короткое время, что позволяет получить всестороннюю структурную характеристику мозга человека.

Introduction

Анализ 3D-молекулярной организации и цитоархитектоники больших объемов человеческого мозга требует оптической прозрачности образцов, достигаемой с помощью протоколов с длительным временем обработки. Методы оптической очистки были разработаны для минимизации гетерогенности показателя преломления (RI) в тканях, тем самым уменьшая рассеяние света и увеличивая глубину проникновения света для визуализации с высоким разрешением 1,2,3,4,5. Современные достижения в области методов очистки и мечения глубоких тканей....

Protocol

Образцы тканей человека, зафиксированные формалином, были предоставлены отделением невропатологии Службы аутопсии Массачусетской больницы общего профиля (MGH) (Бостон, США). Письменное согласие было получено от здоровых участников перед смертью в соответствии с одобренными IRB протокол.......

Discussion

Визуализация с высоким разрешением и 3D-реконструкция больших областей человеческого мозга требуют механического среза тканей с последующим оптическим очищением и иммунометированием отдельных срезов. Протокол, представленный здесь, описывает, как метод трансформации тканей SHORT може?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2'-thiodiethanol	Merck Life Science S.R.L.	166782
Acetamide >= 99.0% (GC)	Merck Life Science S.R.L.	160
Agarose High EEO	Merck Life Science S.R.L.	A9793
Boric Acid	Merck Life Science S.R.L.	B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome	Precisionary	/
Coverslips	LaserOptex	/	customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Merck Life Science S.R.L.	E5134
Glutaraldehyde	Merck Life Science S.R.L.	G7651
Glycine	Santa Cruz Biotechnology	SC_29096
Hydrogen Peroxide 30%	Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075	Lab companion	/
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)	/	/	custom-made
Loctite Attak	Henkel Italia srl	/
Microscope slides	Laborchimica	/	customized
Phospate buffer saline tablet	Merck Life Science S.R.L.	P4417
Picodent Twinsil	Picodent	13005002	out of production
Potassium Hydrogen Phtalate	Merck Life Science S.R.L.	P1088
Sodium Azide	Merck Life Science S.R.L.	S2002
Sodium Dodecyl Sulfate	Merck Life Science S.R.L.	L3771
Sodium Sulfite	Merck Life Science S.R.L.	S0505
Spacers	Microlaser srl		customized
Sputum Containers (dishes with screw lids)	Paul Boettger GmbH & Co. KG	07.061.2000
Tris Base	PanReac AppliChem (ITW reagents)	A4577,0500
Triton X-100	Merck Life Science S.R.L.	T8787
Tubes	Sarstedt	62 547254
Tween 20	Merck Life Science S.R.L.	P9416
Vibratome VT1000S	Leica Biosystem	/
Water bath	Memmert	WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-545-215	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	805-545-180	Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Reasearch	611-605-215	Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody	Merck Life Science S.R.L.	ABN91	Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV)	Abcam	ab32895	Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)	Abcam	ab8069	Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody	ProteinTech	12278_1_AP	Dilution used, 1:200
DAPI	ThermoFisher	D3571	Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175700	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150107	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175470	Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed	Abcam	ab175475	Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150169	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568)	Abcam	ab175711	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647)	Abcam	ab150171	Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150077	Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody	Abcam	ab194324	Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7	Santa Cruz Biotechnology	sc-47706	Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP)	ProteinTech	16233-1-AP	Dilution used, 1:200