העשרה מהירה ויעילה של תאי מיקרוגליה בחוט השדרה של עכבר

Summary

מיקרוגליה נחשבים לחלק מהתאים הרבגוניים ביותר בגוף, המסוגלים להסתגלות מורפולוגית ותפקודית. ההטרוגניות והרב-תכליתיות שלהם מאפשרות שמירה על הומאוסטזיס מוחי, תוך שהם קשורים גם לפתולוגיות נוירולוגיות שונות. כאן מתוארת טכניקה לטיהור מיקרוגליה של חוט השדרה.

Abstract

עמוד השדרה מגדיר חוליה ומעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ושומר על חוט השדרה. התפתחות ותפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית של יונקים מסתמכים באופן משמעותי על פעילותם של מקרופאגים מקומיים המכונים מיקרוגליה. מיקרוגליה מציגה הטרוגניות ורב-תפקודיות, ומאפשרת ביטוי גנים והתנהגות מובחנים בתוך חוט השדרה והמוח. מחקרים רבים בחנו את תפקוד תאי המיקרוגליה במוח, ומפרטים בהרחבה את שיטות הטיהור. עם זאת, טיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה בעכברים חסר תיאור מקיף. לעומת זאת, השימוש בקולגנאז מטוהר מאוד, בניגוד לתמצית לא מזוקקת, חסר דיווח ברקמות מערכת העצבים המרכזית. במחקר זה, עמוד השדרה וחוט השדרה נכרתו מעכברי C57BL/6 בני 8-10 שבועות. העיכול שלאחר מכן השתמש בקולגנאז מטוהר מאוד, וטיהור מיקרוגליה השתמש בשיפוע צפיפות. התאים עברו צביעה לצורך ציטומטריית זרימה, הערכת כדאיות וטוהר באמצעות צביעת CD11b ו-CD45. התוצאות הניבו כדאיות ממוצעת של 80% וטוהר ממוצע של 95%. לסיכום, מניפולציה של מיקרוגליה בעכבר כללה עיכול עם קולגן מטוהר מאוד, ואחריו שיפוע צפיפות. גישה זו יצרה למעשה אוכלוסיות משמעותיות של מיקרוגליה בחוט השדרה.

Introduction

המאפיין המגדיר של בעלי חוליות הוא עמוד השדרה או עמוד השדרה, שבו הנוטוכורד הוחלף ברצף של עצמות מקוטעות הנקראות חוליות, המחולקות על ידי דיסקים בין-חולייתיים. רצף זה של חומר גלוסקמי מעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ומגן על חוט השדרה¹. בסוג Rodentia, עמוד השדרה נוצר בדרך כלל על ידי שבע חוליות צוואריות, שלוש עשרה חוליות בית החזה, שש חוליות מותניות ומספר משתנה של חוליות קאודליות ^2,3. אורך חוט השדרה דומה לזה של עמוד השדרה, והפילום הטרמינלי הוא מבנה לא עצבי המעגן את חוט השדרה לעצה. בנוסף, סיבי עצב יוצאים דרך הפתח הבין חולייתי¹.

התפת....

Protocol

המחקר נערך בהתאם לתקן המקסיקני הרשמי NOM-062-ZOO-1999 והמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. האישור למחקר התקבל מוועדות המחקר, האתיקה והבטיחות הביולוגית של בית החולים לילדים במקסיקו (HIM/2023/006) ומועדת המחקר והביואתיקה של בית החולים הכללי של מקסיקו אדוארדו ליסאגה (DI/21/501/04/62). שלושה עכברי C57BL/6 בגילאי 6 עד 8 .......

Discussion

פרוטוקולים רבים פותחו לחקר תאי מיקרוגליה בשל חשיבותם בהומאוסטזיס של המוח. בשיטות אלה, תאי מיקרוגליה מקורם בדרך כלל בהמיספרות מוחיות של חולדות ועכברים עובריים או יילודים¹⁷. מספר מצומצם של מחקרים התייחסו לטיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה של עכברים בוגרים^13,14

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining