Arricchimento rapido ed efficiente della microglia del midollo spinale del topo

Summary

Le microglia sono considerate alcune delle cellule più versatili del corpo, capaci di adattamento morfologico e funzionale. La loro eterogeneità e multifunzionalità consente il mantenimento dell'omeostasi cerebrale, pur essendo legata a diverse patologie neurologiche. Qui viene descritta una tecnica per purificare la microglia del midollo spinale.

Abstract

La colonna vertebrale definisce un vertebrato e modella il canale spinale, una cavità che racchiude e protegge il midollo spinale. Il corretto sviluppo e la funzione del sistema nervoso centrale dei mammiferi dipendono in modo significativo dall'attività dei macrofagi residenti noti come microglia. Le microglia mostrano eterogeneità e multifunzionalità, consentendo un'espressione genica e un comportamento distinti all'interno del midollo spinale e del cervello. Numerosi studi hanno esplorato la funzione della microglia cerebrale, descrivendo in dettaglio i metodi di purificazione. Tuttavia, la purificazione della microglia dal midollo spinale nei topi manca di una descrizione completa. Al contrario, l'utilizzo di una collagenasi altamente purificata, al contrario di un estratto non raffinato, manca di segnalazione all'interno dei tessuti del sistema nervoso centrale. In questo studio, la colonna vertebrale e il midollo spinale sono stati asportati da topi C57BL/6 di 8-10 settimane. La successiva digestione ha impiegato una collagenasi altamente purificata e la purificazione della microglia ha utilizzato un gradiente di densità. Le cellule sono state sottoposte a colorazione per citometria a flusso, valutando la vitalità e la purezza attraverso la colorazione CD11b e CD45. I risultati hanno prodotto una vitalità media dell'80% e una purezza media del 95%. In conclusione, la manipolazione della microglia di topo ha comportato la digestione con una collagenasi altamente purificata, seguita da un gradiente di densità. Questo approccio ha effettivamente prodotto consistenti popolazioni di microglia del midollo spinale.

Introduction

La caratteristica distintiva dei vertebrati è la colonna vertebrale o colonna vertebrale, in cui la notocorda è stata sostituita da una sequenza di ossa segmentate chiamate vertebre, divise da dischi intervertebrali. Questa successione di materiale osseo modella il canale spinale, una cavità che racchiude e protegge il midollo spinale¹. Nel genere Rodentia, la colonna vertebrale è solitamente formata da sette vertebre cervicali, tredici vertebre toraciche, sei vertebre lombari e un numero variabile di vertebre caudali ^2,3. La lunghezza del midollo spinale è simile a quella dell....

Protocol

Lo studio è stato condotto in conformità con lo standard ufficiale messicano NOM-062-ZOO-1999 e la guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. L'approvazione per lo studio è stata ottenuta dai Comitati di Ricerca, Etica e Biosicurezza dell'Ospedale Pediatrico del Messico (HIM/2023/006) e dal Comitato di Ricerca e Bioetica dell'Ospedale Generale del Messico Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Tre topi C57BL/6 di età compresa tra 6 e 8 settimane sono stati ottenuti dall'Ospedale Pediatrico del Messico, dove .......

Discussion

Numerosi protocolli sono stati sviluppati per lo studio della microglia a causa della loro importanza nell'omeostasi cerebrale. In questi metodi, le microglia provengono tipicamente dagli emisferi cerebrali di ratti e topi embrionali o neonatali¹⁷. Un numero limitato di studi ha affrontato la purificazione della microglia dal midollo spinale di topi adulti^13,14. Queste tecniche prevedono la digestione enzimatica utilizzando collagenasi e/o.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL collection tubes	Corning, USA	430790
2 mL microtubes	Axygen, USA	MCT-200-G
2.4G2 anti-FcR	BioLegend, USA	101302
50 mL collection tubes	Corning, USA	430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)	Gibco, USA	15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse	eBioscience, USA	48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse	BioLegend, USA	103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free	Corning, USA	46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μm	Corning, USA	352340
Costar 6-well Clear Not Treated	Corning, USA	CLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath	Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA	88870001
Dissecting forceps for microsurgery	FT by DUMONT
DNase	Roche, USA	4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM)	Merck, USA	D6429
Electric shaver
FACS tube	Thermo, USA	352058
Fetal bovine serum (FBS)	PAN Biotech, Alemania	P30-3306
Flow cytometer Cytoflex	Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution	Merck, USA	H2387
L-glutamine	Corning, USA	15393631
Liberase TM	Roche, USA	5401119001
Neubauer chamber Counting Chambers	China	1103
Pentobarbital
Percoll	Merck, USA	17089101	density gradient centrifugation
Poly-L-lysine solution	Merck, USA	P8920
Scalpel No. 25	HERGOM, Mexico	H23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL	Axygen, USA	10011-680
Stereoscopic microscope	Velab, Mexico	HG927831
Straight surgical scissors (10 cm)	HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissors	HERGOM, Mexico
Triton X100	Merck, USA	X100
Trypan blue Stain 0.4%	Merck, USA	15250-061
Vortex mixer	DLAB, China	8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend, USA	423102	amine-reactive fluorescent dye staining