Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Микроглия считается одной из самых универсальных клеток в организме, способных к морфологической и функциональной адаптации. Их гетерогенность и многофункциональность позволяют поддерживать гомеостаз мозга, а также связаны с различными неврологическими патологиями. Здесь описана методика очищения микроглии спинного мозга.

Abstract

Позвоночный столб определяет позвоночное животное и формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг. Правильное развитие и функционирование центральной нервной системы млекопитающих в значительной степени зависят от активности резидентных макрофагов, известных как микроглия. Микроглия проявляет гетерогенность и многофункциональность, обеспечивая различную экспрессию и поведение генов в спинном и головном мозге. В многочисленных исследованиях изучалась функция церебральной микроглии, подробно описывались методы очистки. Однако очищение микроглии от спинного мозга у мышей не имеет исчерпывающего описания. В отличие от этого, использование высокоочищенной коллагеназы, в отличие от нерафинированного экстракта, не находит отклика в тканях центральной нервной системы. В этом исследовании позвоночный столб и спинной мозг были вырезаны у 8-10-недельных мышей C57BL/6. В последующем расщеплении использовалась высокоочищенная коллагеназа, а в очистке микроглии использовался градиент плотности. Клетки подвергались окрашиванию для проточной цитометрии, оценивая жизнеспособность и чистоту с помощью окрашивания CD11b и CD45. Результаты показали среднюю жизнеспособность 80% и среднюю чистоту 95%. В заключение, манипуляции с микроглией мыши включали в себя пищеварение высокоочищенной коллагеназой с последующим градиентом плотности. Этот подход эффективно привел к созданию значительных популяций микроглии спинного мозга.

Introduction

Определяющей характеристикой позвоночных является позвоночный столб или позвоночник, в котором хорда заменена последовательностью сегментированных костей, называемых позвонками, разделенных межпозвоночными дисками. Эта последовательность костного материала формирует спинномозговой канал, полость, которая окружает и защищает спинной мозг1. У рода Rodentia позвоночник обычно образован семью шейными позвонками, тринадцатью грудными позвонками, шестью поясничными позвонками и переменным числом хвостовых позвонков 2,3. Длина спинного мозга аналогична длине позвоночника, а концевая н....

Protocol

Исследование проводилось в соответствии с официальным мексиканским стандартом NOM-062-ZOO-1999 и руководством по уходу и использованию лабораторных животных. Одобрение на проведение исследования было получено от комитетов по исследованиям, этике и биобезопасности Детской больницы Мексики.......

Representative Results

С использованием тканей спинного мозга мышей ферментативное пищеварение проводили с использованием смеси, сильно обогащенной коллагеназой и термолизином. Полученная переваренная ткань проходила через фильтр 40 мкм для удаления непереваренного материала. Собранные клетки обогащали ?.......

Discussion

Было разработано множество протоколов для изучения микроглии из-за ее значимости в гомеостазе мозга. В этих методах микроглия обычно поступает из полушарий головного мозга эмбриональных или неонатальных крыс и мышей17. Ограниченное число исследований было посвящено очис?.......

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами стипендии, предоставленной Национальным советом по науке и технологиям (CONACYT) (702361). Авторы отмечают докторантуру по биологическим химическим наукам Национальной школы биологических наук Национального политехнического института.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL collection tubesCorning, USA430790
2 mL microtubesAxygen, USAMCT-200-G
2.4G2 anti-FcRBioLegend, USA101302
50 mL collection tubesCorning, USA430829
70% ethanol
Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)Gibco, USA15240062
Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouseeBioscience, USA48-0112
Antibody CD45 PerCP anti-mouse  BioLegend, USA103130
Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-freeCorning, USA46-013-CM
Blue Cell Strainer 40 μmCorning, USA352340
Costar 6-well Clear Not Treated Corning, USACLS3736
Coverslips
Digital Heating Shaking Drybath Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA88870001
Dissecting forceps for microsurgeryFT by DUMONT
DNaseRoche, USA4536282001
Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) Merck, USAD6429
Electric shaver
FACS tubeThermo, USA352058
Fetal bovine serum (FBS)PAN Biotech, AlemaniaP30-3306
Flow cytometer Cytoflex Beckman Coulter
Hank’s balanced salt solution Merck, USAH2387
L-glutamineCorning, USA 15393631
Liberase TM Roche, USA5401119001
Neubauer chamber Counting ChambersChina1103
Pentobarbital
Percoll Merck, USA17089101density gradient centrifugation 
Poly-L-lysine solution Merck, USAP8920
Scalpel No. 25 HERGOM, MexicoH23
Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mLAxygen, USA10011-680
Stereoscopic microscopeVelab, MexicoHG927831
Straight surgical scissors (10 cm)HERGOM, Mexico
Straight Vannas scissorsHERGOM, Mexico
Triton X100Merck, USAX100
Trypan blue Stain 0.4% Merck, USA15250-061
Vortex mixerDLAB, China8031102000
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend, USA423102amine-reactive fluorescent dye staining 

References

  1. Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
  2. Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
  3. Bab, I., et ....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved